潛在抑癌基因eIF4E3野生型和突變體質粒的構建*

姚運紅，袁 煒，熊敏涵，張 葉，胡新榮

廣東醫科大學病理學系、腫瘤研究所，廣東 東莞 523808

真核翻譯起始因子4E（Eukaryotic translation initiation factor 4E，eIF4E），是真核細胞翻譯起始和調控的核心成分，能夠選擇性地控制腫瘤基因的翻譯和表達。目前已經明確在哺乳動物中eIF4E有三種不同的家族成員，包括eIF4E1、eIF4E2、eIF4E3，其在結構標記、功能特征及表達形式上各有不同［1］。eIF4E3是抑癌基因，eIF4E在眾多腫瘤中過量表達［2］。過量表達的eIF4E選擇性地起始c-Myc等眾多經典癌基因的翻譯表達，從而促進癌細胞轉化、增殖、抗凋亡、侵襲及腫瘤血管生成等［3］。本研究擬構建并鑒定eIF4E3野生型、eIF4E3突變體C69a、w86a真核過表達質粒，為進一步對eIF4E3研究及為腫瘤治療尋找新的靶點提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株及表達載體： 大腸桿菌（Escherichia coli）菌株DH5a、PIRES2-EGFP載體（本實驗保存），eIF4E3野生型插入片段序列，eIF4E3C69a突變體是eIF4E3野生型在69位點C變為A突變而來；eIF4E3W86a突變體是eIF4E3野生型在86位點W變為A突變而來。主要試劑：EcoRI、BamHI、NheI限制性內切酶（美國NEB公司）PCR產物回收試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒（日本TAKARA公司）T4 DNAligase（美國Thermo公司）Gold View I型核酸染色劑（北京Solarbio公司）高純度質粒小提中量試劑盒（北京天根公司）。

1.2 方法

1.2.1 eIF4E3基因片段、RT-PCR擴增及產物純化：eIF4E3、eIF4E3C69a、eIF4E3W86a質粒載體構建，參照公司質粒構建說明書。實驗步驟如下：逆轉錄反應（RT-PCR）擴增獲得 cDNA樣本。RT-PCR擴增條件：37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃保存。以cDNA樣本為模板，用構建的上下游引物進行PCR擴增獲得eIF4E3野生型及其突變體序列片段。eIF4E3 PCR引物上游引物序列為：primer 5'-GGCGAATTCATGGCGCTGCCCCCG-3'，下游引物序列為：primer 5'-GCGGATCCTTAGTGTTTTCCACGTC?CACCTTCA-3'，PCR反應體系為：2×power Taq PCR Mas?ter Mix 10 μl，Forward Primer P1（10 μM）1 μl，Reverse Primer P1（10 μM）1 μl，cDNA Template100ng ddH2O 總量加到20 μl，反應條件94℃預變性5 min，94℃變性45S，55℃退火1 min，72℃延伸5 min 40個循環，取適量產物，用1%瓊脂糖凝膠電泳實驗鑒定產物，鑒定結果正確，PCR產物剩余部分用PCR產物回收試劑盒回收并純化（試劑盒說明書），回收產物于-20℃保存。……