潛在抑癌基因eIF4E3野生型和突變體質粒的構建*

姚運紅，袁 煒，熊敏涵，張 葉，胡新榮

廣東醫科大學病理學系、腫瘤研究所，廣東 東莞 523808

真核翻譯起始因子4E（Eukaryotic translation initiation factor 4E，eIF4E），是真核細胞翻譯起始和調控的核心成分，能夠選擇性地控制腫瘤基因的翻譯和表達。目前已經明確在哺乳動物中eIF4E有三種不同的家族成員，包括eIF4E1、eIF4E2、eIF4E3，其在結構標記、功能特征及表達形式上各有不同［1］。eIF4E3是抑癌基因，eIF4E在眾多腫瘤中過量表達［2］。過量表達的eIF4E選擇性地起始c-Myc等眾多經典癌基因的翻譯表達，從而促進癌細胞轉化、增殖、抗凋亡、侵襲及腫瘤血管生成等［3］。本研究擬構建并鑒定eIF4E3野生型、eIF4E3突變體C69a、w86a真核過表達質粒，為進一步對eIF4E3研究及為腫瘤治療尋找新的靶點提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株及表達載體： 大腸桿菌（Escherichia coli）菌株DH5a、PIRES2-EGFP載體（本實驗保存），eIF4E3野生型插入片段序列，eIF4E3C69a突變體是eIF4E3野生型在69位點C變為A突變而來；eIF4E3W86a突變體是eIF4E3野生型在86位點W變為A突變而來。主要試劑：EcoRI、BamHI、NheI限制性內切酶（美國NEB公司）PCR產物回收試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒（日本TAKARA公司）T4 DNAligase（美國Thermo公司）Gold View I型核酸染色劑（北京Solarbio公司）高純度質粒小提中量試劑盒（北京天根公司）。

1.2 方法

1.2.1 eIF4E3基因片段、RT-PCR擴增及產物純化：eIF4E3、eIF4E3C69a、eIF4E3W86a質粒載體構建，參照公司質粒構建說明書。實驗步驟如下：逆轉錄反應（RT-PCR）擴增獲得 cDNA樣本。RT-PCR擴增條件：37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃保存。以cDNA樣本為模板，用構建的上下游引物進行PCR擴增獲得eIF4E3野生型及其突變體序列片段。eIF4E3 PCR引物上游引物序列為：primer 5'-GGCGAATTCATGGCGCTGCCCCCG-3'，下游引物序列為：primer 5'-GCGGATCCTTAGTGTTTTCCACGTC?CACCTTCA-3'，PCR反應體系為：2×power Taq PCR Mas?ter Mix 10 μl，Forward Primer P1（10 μM）1 μl，Reverse Primer P1（10 μM）1 μl，cDNA Template100ng ddH2O 總量加到20 μl，反應條件94℃預變性5 min，94℃變性45S，55℃退火1 min，72℃延伸5 min 40個循環，取適量產物，用1%瓊脂糖凝膠電泳實驗鑒定產物，鑒定結果正確，PCR產物剩余部分用PCR產物回收試劑盒回收并純化（試劑盒說明書），回收產物于-20℃保存。

1.2.2 目的片段eIF4E3及空載質粒PIRES2-EGFP雙酶切與純化、回收：用限制性內切酶EcoRI、BamHI雙酶切eIF4E3基因片段及空載質粒PIRES2-EGFP。用限制性內切酶NheI、BamHI分別雙酶切eIF4E3C69a、eIF4E3W86a基因片段及空載質粒PIRES2-EGFP。將eIF4E3酶切產物進行回收；提取的質粒經瓊脂糖凝膠電泳，找到相應的目的條帶切膠并回收。

1.2.3 目的片段和載體質粒的連接和轉化、提取、鑒定：使用T4 DNA Ligase產品將目的片段與線性載體進行連接，連接產物轉化感受態大腸桿菌DH5α。挑選長出的克隆并搖菌擴增，提取質粒進行后續PCR及測序。PCR引物和擴增的反應體系和反應條件同上。擴增出的目的片段為675bp。重組質粒雙酶切鑒定真核表達載體PIRES2-EGFP具有卡那霉素抗性，本實驗中選取酶切位點分別為Eco?RI、BamHI，NheI、BamHI。根據內切酶說明書，對重組質粒進行雙酶切鑒定。將酶切產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，成像儀下曝光并拍照。重組DNA測序將提取的質粒DNA送往華大基因生物技術有限公司測序并分析結果。

2 實驗結果

2.1 目的基因eIF4E3擴增結果

PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，從擴增圖可以看到3條大小約為675bp的條帶，與預期的野生型（eIF4E3）和突變型（C69a、W86a）基因大小一致（圖1）。

圖1 eIF4E3野生型和突變體基因PCR擴增電泳圖

2.2 重組質粒PIRES2-EGFP-eIF4E3、PIRES2-EGFP-C69a、PIRES2-EGFP-W86a雙酶切及鑒定結果

經過瓊脂糖凝膠電泳分析以后回收得到的PCR產物與PIRES2-EGFP空載體進行雙酶切后，用連接酶進行連接用含有卡那霉素的LB培養基進行鋪板長菌，挑取2～3個單克隆進行擴增并提取質粒最后進行雙酶切及PCR鑒定。雙酶切后可以得到大約675bp的片段（圖2），進一步進行菌液及其質粒的PCR鑒定，同樣可以看出大約675bp的片段（圖3），說明eIF4E3野生型及其突變體成功插入到PIRES2-EGFP載體上。

圖2 eIF4E3野生型和突變體重組質粒雙酶切鑒定圖

圖3 eIF4E3野生型和突變體菌液及質粒PCR電泳圖

2.3 重組質粒測序結果

將重組質粒PIRES2-EGFP-eIF4E3、PIRES2-EGFP-eIF4E3C69a、PIRES2-EGFP-eIF4E3C69W86a上插入的目的基因eIF4E3、C69a、W86a片段進行DNA測序，經過Blast比對和分析，結果顯示eIF4E3、C69a、W86a基因正確插入到真核表達載體PIRES2-EGFP中，其與目的序列一致，測序結果（圖4）。

3 討論

圖4 eIF4E3野生型和突變體質粒測序圖

eIF4E3是最近年新發現的一種潛在的抑癌基因。本實驗中我們成功的將eIF4E3、eIF4E3C69a、eIF4E3W86a基因鏈接到真核表達載體pIRES2-EGFP中。我們選用的pIRES2-EGFP真核表達載體容易進入細胞，容量比較大，易于檢測，在臨床實驗中應用比較廣泛。eIF4E3僅存在脊索動物中，而且研究發現只存在于脊索動物的睪丸、骨骼肌、心肌、脾臟和肺臟等組織中，尤其在睪丸中表達水平最高［3］。2013年Borden［4］等人的研究發現過表達eIF4E3能夠競爭結合eIF4E的靶mRNA，并且能夠阻止VEGF等因子的翻譯表達，這提示eIF4E3是對抗eIF4E的潛在抑癌基因。過表達eIF4E3可與eIF4E競爭結合eIF4E的靶mRNA，例如CyclinD1、c-Myc、VEGF等并阻止其翻譯表達。Gartenhaus［5］等人進一步發現eIF4E3除了抑制eIF4E1的功能外，還可以自己起始n-Myc、HMGA、CDX2、Twist等的翻譯，而這些基因通常都不是eIF4E1的靶基因，這表明eIF4E3可以起始不同于eIF4E1的靶基因的翻譯。此外，在藥物、放射、缺氧、缺營養等條件下，eIF4E表達下降［6-8］，因此eIF4E已成為研究腫瘤靶向治療的最熱門靶點之一［9］。

本實驗成功構建了PIRES2-EGFP-eIF4E3野生型，PIRES2-EGFP-eIF4E3 C69a、PIRES2-EGFP-eIF4E3 w86a突變體質粒，經測序檢測，序列與預期相符。eIF4E3野生型，突變體 C69a、w86a的構建為進一步研究其在腫瘤的作用及機理，為腫瘤治療尋找新的靶點奠定了基礎。