非小細胞肺癌組織中性別決定區(qū)Y框蛋白2、糖原合成酶激酶-3β表達觀察

楊岳峰，王茜，劉利玲，李帥，李娟

1成都醫(yī)學院，成都 610500；2成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院

肺癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅人類健康，每年新增患者超過200萬人[1]，其中女性患者增幅更加明顯。根據(jù)組織類型的不同，將肺癌分為小細胞肺癌(SCLC)和非小細胞肺癌(NSCLC)，后者約占80%[2]。近年來，盡管腫瘤的治療不斷取得進展，新的靶向藥物相繼上市，但NSCLC患者五年生存率仍低于20%[3]。性別決定區(qū)Y框蛋白2(SOX2)位于3q26.3-q27上，是性別決定區(qū)家族基因成員之一，其異常表達與腫瘤干細胞發(fā)生有密切聯(lián)系，對腫瘤惡性生物學過程有促進作用[4,5]。糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)是一種絲氨酸—蘇氨酸蛋白激酶，能促進線粒體介導死亡內(nèi)源性細胞凋亡和抑制死亡受體介導的外源性細胞凋亡[6,7]，與卵巢癌、膠質(zhì)瘤等的增殖、分化有關(guān)[8,9]。研究認為，GSK-3β是NSCLC的主要負調(diào)控因子，表達缺失會促進腫瘤干細胞自我更新誘發(fā)腫瘤形成。但SOX2、GSK-3β在NSCLC中作用的相關(guān)性尚不明確。本研究觀察了NSCLC癌組織中SOX2、GSK-3β的表達變化，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年1～12月西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院收治的NSCLC患者42例，男26例，女16例；年齡43～77歲，其中60歲19例、>60歲23例；低分化14例，中分化16例，高分化12例；組織學類型為腺癌25例，鱗癌17例；根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(UICC)肺癌TNM分期系統(tǒng)第七版進行分期，Ⅰ期19例，Ⅱ期13例，Ⅲ期10例；腫瘤直徑>3 cm者有15例，3 cm者27例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移15例，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例；有吸煙史22例，無吸煙史20例；侵犯被膜26例，未侵犯被膜16例。納入標準：①所有組織標本均經(jīng)病理科高級職稱醫(yī)師復閱切片，確診為NSCLC(2015年WHO肺腫瘤組織學分類標準)；②入組患者術(shù)前均未行放、化療或其他治療；③一般情況可，無嚴重肝腎疾病。手術(shù)留取NSCLC組織及其對應(yīng)癌旁組織(距腫瘤組織2.0 cm以上)各42例份(分別記為腫瘤組和癌旁組)，標本的獲取提前與患者及其家屬溝通獲得其知情同意。

1.2 組織中SOX2、GSK-3β檢測方法 采用免疫組化SP法。標本常規(guī)石蠟包埋，切片，切片厚3～4 mm，常規(guī)用二甲苯脫蠟、乙醇復水，用內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑(3%的過氧化氫)阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，在微波爐中用檸檬酸鹽緩沖劑進行抗原修復，抗原的位點充分暴露，用山羊血清恒溫孵育封閉內(nèi)源性非特異性抗原，加一抗SOX2(濃度1∶200，一般為50 μL/每片)，于4 ℃冰箱中過夜，加二抗試劑3(山羊抗兔型)、二抗試劑4(辣根霉標記鏈霉卵白素工作液)，DAB顯色，染色及鹽酸酒精分色，脫水透明，封片，癌旁正常組織作陰性對照。SOX2蛋白定位于細胞核，細胞核中出現(xiàn)棕色顆粒為陽性表達；GSK-3β蛋白位于細胞質(zhì)中，細胞質(zhì)中出現(xiàn)黃色顆粒為陽性表達。采用半定量計分法判斷SOX2、GSK-3β的表達強度：以切片中陽性細胞染色深淺評分，無著色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分；以切片中陽性細胞比例評分，隨機計數(shù)5個高倍視野，陽性細胞數(shù)<5%計0分，6%～25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，>75%計4分；兩計分相乘取平均值，均值<1為陰性，其余為陽性。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法，兩定性資料的關(guān)聯(lián)性分析使用Pearson列聯(lián)系數(shù)，等級資料的相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組SOX2、GSK-3β陽性率比較 腫瘤組和癌旁組SOX2陽性率分別為73.8%、4.8%，GSK-3β陽性率分別為47.6%、100%，兩組比較，P均<0.05(見圖1、圖2)。

圖1 SOX2在鱗癌中的表達(×400)

圖2 GSK-3β在腺癌中的表達(×200)

2.2 SOX2、GSK-3β表達與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系 結(jié)果見表1，由表1可知，SOX2表達與NSCLC分化程度呈負相關(guān)，GSK-3β表達與NSCLC是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(P均<0.05)。

表1 SOX2、GSK3-β表達與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系

2.3 NSCLC組織中SOX2、GSK-3β表達的相關(guān)性 NSCLC組織中SOX2與GSK-3β表達無相關(guān)性(P>0.05)。

3 討論

肺癌是世界范圍內(nèi)惡性腫瘤死亡的首要原因，由于早期癥狀不典型，多數(shù)患者就診時已處于晚期，導致其預后差。近年來，肺癌的早期診斷標志物、治療靶點以及預后標志物成為研究的熱點。腫瘤干細胞在腫瘤的發(fā)展中具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，SOX2和 GSK-3β的表達與腫瘤干細胞的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。但目前關(guān)于SOX2和 GSK-3β在NSCLC中的表達情況少有報道，本實驗希望探討兩者在NSCLC的表達及其臨床意義。

干細胞轉(zhuǎn)錄因子SOX2是SOX家族成員之一，在胚胎干細胞發(fā)育過程中對維持胚胎干細胞特性和重編程起關(guān)鍵作用，與靶基因G結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合調(diào)控細胞分化[10,11]。SOX2異常表達與腫瘤干細胞發(fā)生有密切聯(lián)系，對腫瘤惡性生物學過程有促進作用。已證實在胰腺癌、結(jié)直腸癌、宮頸癌、乳腺癌、多發(fā)性骨髓瘤中表達升高[12～15]。研究[16]發(fā)現(xiàn)，腫瘤的形成、轉(zhuǎn)移、入侵過程會消耗干擾素跨膜蛋白1(IFITM1)，體內(nèi)IFITM1缺少會使腫瘤受抑制，SOX2表達會一定程度彌補IFITM1缺乏，從而繼續(xù)促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。人類GSK-3β基因包含12個外顯子，定位于1號外顯子,基因產(chǎn)物為46 kD蛋白質(zhì)，包含433種氨基酸。GSK-3β在細胞增殖、細胞周期的連續(xù)性，胚胎發(fā)育[17]及胰島素反應(yīng)[18]等生理過程中都具有重要作用，并與阿爾茲海默癥及抑郁癥發(fā)生有關(guān)。腫瘤方面，GSK-3β被認為是腫瘤潛在的調(diào)控因子，尤其是在Wnt/β-catenin信號通路中的調(diào)節(jié)作用被廣泛認同，β-catenin進入胞核與含高遷移率組(HMG)特征性結(jié)構(gòu)域的因子形成復合物促進Wnt信號靶基因轉(zhuǎn)錄，被異常激活的Wnt信號靶基因與細胞增殖活化異常及腫瘤形成有密切關(guān)系，胞核中β-catenin被GSK-3β磷酸化后可抑制這一過程[7,8]。SOX2與GSK-3β對腫瘤某些方面有相似的生物學效應(yīng)。GSK-3β在Wnt/β-catenin信號通路中發(fā)揮作用被認為是其調(diào)控腫瘤的主要途徑。SOX2通過ChIP結(jié)合在β-catenin的啟動子區(qū)域上，對β-catenin發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。

本研究顯示，SOX2在NSCLC癌組織中陽性率為73.8%，在癌旁組織中陽性率為4.8%，SOX2在NSCLC癌組織中呈高表達,提示SOX2的異常調(diào)節(jié)可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。SOX2表達與NSCLC腫瘤分化程度有關(guān)，SOX2表達越高，腫瘤分化程度越低。而與患者性別、年齡、組織學類型、TNM分期、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、被膜侵犯均無關(guān)。因此，SOX2可能是NSCLC的始動因素之一并能影響腫瘤的分化。NSCLC組織中GSK-3β陽性率為47.6%，較癌旁組織的表達顯著下調(diào)，推測其表達異常可能影響腫瘤的發(fā)生。GSK-3β表達與NSCLC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示其可能影響腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力。利用兩者在調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路方面有平行關(guān)系可以解釋當腫瘤正性調(diào)控因素(SOX2陽性、GSK-3β陰性)同時出現(xiàn)時腫瘤發(fā)生率明顯高于同時不出現(xiàn)(38.1%和14.3%)，同時表達時生物學效應(yīng)更強。本研究顯示，NSCLC組織中SOX2和GSK-3β表達無相關(guān)性，可能與樣本量偏少有關(guān)，尚需更大規(guī)模的進一步實驗研究予以闡明。

總之，NSCLC組織中SOX2表達升高，GSK-3β表達降低，SOX2和GSK-3β的表達與NSCLC的發(fā)生發(fā)展可能有關(guān)，聯(lián)合檢測有望為NSCLC早期診斷及分析、靶向治療和預測預后提供參考。