石榴果腐病病原的分離鑒定

暢引東，賈 俊，解宇潔，李榮榮，史錦淑，陳 興，王建明

（1.山西農業大學農學院，山西太谷030801；2.晉中市規劃和自然資源局，山西晉中030600；3.太原師范學院，山西太原030619）

石榴（Punica granatum L.）為落葉喬木或灌木，在我國已有2 000 多年的栽培歷史[1]。山西省晉南地區氣候溫和，日照充足，土層深厚，適合石榴的生長。該地區自古以來就有種植石榴的習俗，既有家庭院落栽培，也有集中成片種植[2]，現今僅運城臨猗縣年產石榴就可達4.5 萬t[3]。近年來，隨著社會經濟的發展，人們對健康生活有了更高的追求。石榴果實因其含有豐富的天然活性物質，具有抗衰老、預防動脈粥樣硬化和減緩癌變進程等作用[4-5]，越來越受到大眾的青睞。市場需求的增大、政府“一村一品、一縣一業”政策的實施，以及當地石榴種植傳統優勢等都極大地促進了當地石榴產業的發展。

隨著石榴種植規模的擴大，地區間品種調用、產業升級等對石榴果園的管理提出更高的要求。石榴在生長和貯藏過程中極易遭受多種病原侵染，引起果樹樹勢減弱、果實腐爛和商品性下降等問題。目前已發現的石榴病害主要由病原真菌侵染造成。截止目前，已報道的石榴病害的病原真菌主要有甘薯長喙殼（Catalysts fimbriation Ellis et Halted）、疫霉菌（Phytophthora sp.）、厚盤單毛孢（Monochaetia pachyspora Bubak）、石榴尾孢霉（Cercospora punicae P. Henn.）、石榴生尾孢霉（Cercospora punicola）、煤炱菌（Capnodium sp.）、膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides（Penz.）Sacc.）、石榴墊殼孢（Coniella granati （Sacc.）Petr. & Syd）、柑 橘 葡 萄 座 腔 菌（Botryosphaeria rhodina（Berk.et Curt.）Shoemaker）、石榴擬莖點霉（Phomopsis punicae）、石榴痂圓孢（Sphaceloma punicae Bitancourt et Jenkins）、黑曲霉（Aspergillus niger V. Tiegh.）、青霉菌（Penicillium sp.）等等，分別引發石榴枯萎病（為害根莖）、石榴疫腐?。楹涓汕o基部）、石榴葉枯?。楹θ~片）、石榴褐斑?。楹θ~片和果實）、石榴黑斑病（為害葉片和果實）、石榴霉污?。楹θ~片和果實）、石榴炭疽病（為害果實，也可為害葉片和枝條）、石榴干腐?。楹麑嵑椭Ω桑?、石榴焦腐?。楹麑崳⑹竦俑。楹麑崳?、石榴瘡痂?。楹麑崳⑹袂共。楹麑崳┖颓嗝共。楹麑崳┑?0 多種病害[6-12]。這些病害中多數是由一些常見病原真菌侵染引起，在我國各地多有發生，也有個別是在多地已有發生的檢疫性病害[6，8，10]。由此可見，加強對新病害的調查研究，對做好植物檢疫工作具有重要的理論和實踐意義。

近年，在山西省運城市洪洞縣石榴果實上發現一種石榴病害。據農戶描述，在最初僅發現有個別病果，后來幾乎在所有果實上都產生了類似病斑。此現象在往年已有發現，之后該病害年年出現，噴施藥劑防治效果欠佳?？紤]到該石榴樹所處農戶院落緊鄰石榴果園，其果實病狀與以往發現果實病狀有出入。因此，明確該病害的致病病原對該種病害的防治及當地石榴果業的健康發展具有積極的指導意義。

本研究對采集自山西省洪洞縣的石榴病果，運用形態學和分子生物學鑒定相結合的方法明確引發該病害的致病病原，旨在為該病害的防治提供有效的理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

供試石榴病果采集自山西洪洞縣。

1.2 試劑與儀器

試驗中選用的培養基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（Potato Dextrose Agar，PDA）、查氏酵母膏瓊脂培養基（Czapek Yeast Extract Agar，CYA）和燕麥瓊脂培養基（Oatmeal Agar，OA）[13]。

CTAB 緩沖液[14]、Taq PCR Mix 預混液、Green 核酸染色劑、1 倍TAE 電泳緩沖液、6 倍上樣緩沖液、DNA marker D（100～2 000 bp）和DNA Marker S（100～5 000 bp）（生工生物工程（上海）股份有限公司）。

凈化工作臺（SW-CJ-2FD，上海博迅實業有限公司），智能光照培養箱（GTOP-Y 系列，浙江托普儀器有限公司），OLYMPUS 光學顯微鏡（BX51，日本奧林巴斯），高壓蒸汽滅菌鍋（YXQ-LS-70A，上海博迅實業有限公司），熱空氣消毒箱（GR-240，上海博迅實業有限公司），電子天平（BSA224S，德國賽多利斯），數顯恒溫水浴鍋（HH-2，常州國華電器有限公司），高速離心機（Thermo Sorvall ST 16RT，賽默飛世爾科技（中國）有限公司），PCR 儀（T100，伯樂（中國）有限公司），電泳儀（PowerPacTMBasic，伯樂（中國）有限公司），凝膠電泳成像分析儀Bio-Rad PCR 儀（Universal Hood ll，伯樂（中國）有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 病原菌的分離純化 采用組織分離法于果實表面病健交界處切取3～5 mm 的正方體組織，在75%的酒精溶液內浸泡2～3 s，后用無菌水沖洗3 次，用滅菌濾紙吸干表面水分，移至PDA 平板上，在25 ℃的恒溫培養箱中培養3～4 d，將組織上長出的菌落轉接至新的PDA 平板進行純培養，將分離菌株進行單孢純化后轉入PDA 培養基作為菌種保存備用[13]。病果內部病原菌的分離可用滅菌小刀切開石榴，挑取病果內部患病組織，放在PDA 平板上，于25 ℃恒溫培養箱中培養2～3 d，隨后將分離菌株單孢純化后轉入PDA 培養基作為菌種保存備用[13]。

1.3.2 菌株致病性測定 采用致傷接種法[13]，在超凈工作臺內用75%酒精對石榴果實進行表面消毒，再用無菌水進行沖洗，晾干后備用；將純化菌株制成濃度為1×106個/mL 的孢子懸浮液，采用針刺法接入健康石榴果實的中部，以無菌水接種作為空白對照，每個回接試驗設3 次重復；將回接的石榴果實放入塑料盒內的培養皿上，用PE 保鮮膜封口，放置于25 ℃恒溫培養箱內培養，培養皿與塑料盒之間的空隙處塞入無菌水浸濕的脫脂棉做保濕處理。隨后每天觀察果實的發病情況，并做記錄。

1.3.3 菌株形態學鑒定 將純化的菌株轉接到PDA 平板上，此后3～7 d 測量菌落直徑，在第4 天記錄氣生菌絲特性和培養物色澤，并在顯微鏡下觀察菌株的分生孢子的有無、數量、大小、形狀以及產孢結構等顯微形態特征，記錄并拍照；對在PDA 培養基上觀察不到孢子的菌株，則轉接至OA 培養基和CYA 培養基上進行培養，觀察其有無孢子或子實體產生，以及其產生所需的時間，并對菌落特征和顯微形態進行拍照和記錄。最后參考《中國真菌志》和《真菌鑒定手冊》[15-16]進行分類鑒定。

1.3.4 菌株分子鑒定 采用CTAB 法對菌株基因組DNA 進行提取[14]。以供試菌株基因組DNA 為模板，選用真菌通用引物ITS1（5′- TCCGTAGGTGAA CCTGCG-3′）和ITS4（5′- TCCTCCGCTTATTGATA TGC-3′）對病原菌rDNA 的ITS 區進行PCR 擴增?？偡磻w系為20 μL，包括DNA 模板1 μL、Taq PCR Mix 預混液6 μL、ITS1 和ITS4 引物各1 μL，ddH2O 補足至20 μL。PCR 擴增程序為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共循環34 次；最后72 ℃再次延伸5 min。擴增產物在恒壓110 V 下用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增結果由上海生工生物工程有限公司進行測序，將得到的序列在NCBI 的GenBank 數據庫中進行Blast 比對，獲得相似度高的核苷酸數據，利用MEGA 6 軟件對獲取的序列構建鄰接樹進行系統發育分析[17]。

2 結果與分析

2.1 石榴病害癥狀

山西省洪洞縣采集的石榴病果的病狀為果實外部表面具有規則的圓形輪紋狀病斑，邊緣處為白色暈圈，由邊緣至病斑中央色澤從黃褐色逐漸加深為棕褐色，輪紋中央為褐色至深褐色（圖1-A）。石榴病果實內部已大部分褐化，自病果的萼筒處到果實內部布滿黑褐色的霉層，且具有灰白色的菌絲。籽粒間松散，部分籽粒喪失水分，且上布滿黑色、白色的霉層（圖1-B）。采集的供試病果后期逐漸失水干枯，形成僵果。

2.2 菌株分離純化和致病性測定結果

從采集的石榴果實樣品中通過組織分離法和直接挑取分離法，共分離純化得到3 種特征各異的真菌菌株，分別編號為SLX、SLY 和SLZ。經柯赫氏法則回接鑒定證明，3 種菌株接種后，菌株SLX 和菌株SLY 可以侵染石榴果實引起發病，而菌株SLZ則未能引起發病（圖2）。從接種發病的果實上分離純化的病原菌與該分離菌株在形態上相同，因此，可確定該分離物是病原菌。

菌株回接4 d 時，菌株SLX 回接果實表面出現黃色病斑，菌株SLY 回接果實表面出現灰白色點狀霉層，菌株SLZ 回接果實表面與空白對照相同。在菌株回接4～7 d 時，菌株SLX 回接果實表面病斑逐漸向外擴大，中央出現黑褐色輪紋且伴有白色菌絲，邊緣為淡黃色暈圈，從邊緣至病斑中央色澤從淡黃色逐漸加深為棕褐色，中央出現黑褐色輪紋且伴有灰白色菌絲（圖2-A）；菌株SLY 回接果實表面原先的灰白色點狀霉層逐漸變為黑色霉層，黃褐色病斑逐漸擴大（圖2-B）；菌株SLZ 回接后未能在石榴果實上侵染擴展，僅有稍許菌絲匍匐生長在果實表面（圖2-C），與空白對照果實表面相同，無明顯的病狀（圖2-D）。

2.3 菌株形態學鑒定結果

根據病原菌的菌落表面形態及顯微形態，參照《中國真菌志》及《真菌鑒定手冊》進行鑒定，結果表明，菌株SLX 為石榴墊殼孢（Coniella granati（Sacc.）Petr. &Syd），屬半知菌亞門（Fungi Imperficti）殼霉目（Sphaeropsidales）殼霉科（Sphaeropsicaceae）。有性態為石榴小赤殼菌（Nectriella versoniana Sacc. et Penz），屬 子 囊 菌 綱（Ascomycetes） 肉 座 菌 目（Hypocreales）叢赤殼科（Nectriaceae）。菌株SLY 為黑曲霉（Aspergillus niger），屬半知菌綱殼霉目杯霉科（Discellaceae）。菌株SLZ 為黑附球菌（Epicoccum nigrum），屬半知菌綱殼霉目杯霉科。

2.3.1 石榴墊殼孢Coniella granati（Sacc.）Petr.&Syd（菌株SLX） 在PDA 培養基上菌絲為白色，呈輪紋狀向外擴展，菌絲稀疏，每輪菌絲呈波浪狀。菌絲生長速率為1.0～1.1 cm/d（圖3-A、B）。培養至7 d時已滿皿，發現無產孢后接入CYA 培養基，菌絲為白色，初期呈放射狀花朵形態向外展開，生長速率為1.2～1.3 cm/d（圖3-C、D）。第5～6 天中央出現黑色分生孢子器，裸生或半埋生于培養基中，逐漸向外擴展，培養至第10～12 天時菌絲消失，黑色分生孢子器布滿整個培養基（圖3-E、F）。

在光學顯微鏡下觀察到分生孢子器呈鵝蛋型，黑褐色，大小為（115～140）μm×（90～135）μm（圖4-A、B）。產孢區有墊狀凸起，呈雪花狀的鏈式結構，無色光滑（圖4-C）。分生孢子呈紡錘形，無色或淡褐色，無隔，表面光滑，大小為（9～13）μm×（3～4）μm（圖4-D）。

2.3.2 黑曲霉Aspergillus niger（菌株SLY） 在PDA培養基上初期為白色，菌絲致密無褶皺。2～3 d 后長出黑色孢子，表面黑色絲絨狀，中心凸起，有放射狀溝紋，邊緣有白色氣生菌絲，粗糙（圖5-A）。生長速率為0.4～0.5 mm/d，培養至7 d 時菌落直徑達到4 cm（圖5-B）。

在光學顯微鏡下觀察到分生孢子梗為（25～30）μm×（150～200）μm，頂端的分生孢子頭呈膨大球形頂囊，直徑180～230 μm，淡黑褐色，頂囊產孢區全面覆有產孢梗，雙層（圖6-A）。分生孢子球形，光滑，直徑為2.5～3.8 μm（圖6-B）。

2.3.3 黑附球菌Epicoccum nigrum（菌株SLZ） 初期菌絲為粉色偏白，5 ～6 d 后由內向外顏色加深為橘粉色，后期中間菌絲呈環凸起，菌絲稠密，生長速率為3～5 mm/d，培養至7 d 時菌落直徑達到3 cm（圖7-A、B）。培養至12 d 時發現無產孢，接入OA培養基，菌絲為白色、稀疏，呈放射狀平鋪延伸，生長速率為6～7 mm/d，較PDA 生長速率快。4～5 d 后從中央向外逐漸生成黑色顆粒（圖7-C、D），10～11 d時滿皿，菌株中央產生的黑色顆粒較多，向外逐漸減少（圖7-E）。

在光學顯微鏡下觀察到無色光滑的菌絲體，寬1～2 μm，多數分枝。淡褐色短粗的分生孢子梗（3～5）μm×（1～2）μm，有隔（1～2 個）或無隔（圖8-A）。分生孢子梗頂端膨大處生出球形分生孢子，初無色或淡褐色，后黃褐色、黑褐色，無隔。分生孢子表面粗糙，直徑大小為20～30 μm（圖8-B）。

2.4 菌株分子鑒定結果

以菌株SLX、SLY 和SLZ 的基因組DNA 為模板，用真菌通過引物ITS1/ITS4 對病原菌rDNA的ITS區進行PCR 擴增。經測序分析，3 個菌株SLX、SLY和SLZ 的擴增產物長度分別為518、559、585 bp，將所得序列在GenBank 序列數據庫中進行同源序列比對，從中選取顯示明確屬種、一致性高、覆蓋率高（＞98%）的序列，以尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum）為外群，利用MEGA 6 軟件進行的系統發育分析結果如圖9 所示。

由圖9 可知，3 個菌株通過聚類劃分為3 組，組間的相關性存在明顯差異。菌株SLX 與所選的石榴墊殼孢菌株（Coniella granati）的序列同源性達到99.82%以上；菌株SLY 與所選的黑曲霉（Aspergillus niger）菌株的序列同源性達到99.12%以上；菌株SLZ 與所選的黑附球菌（Epicoccum nigrum）菌株的序列同源性達到99.61%以上。通過ITS 序列分析可將菌株SLX、SLY 和SLZ 分別鑒定為Coniella granati、Aspergillus niger 和Epicoccum nigrum。

3 結論與討論

本試驗通過形態學、分子生物學手段和致病性試驗對引起山西省洪洞縣石榴果腐病的病原進行了鑒定，明確引起果實腐爛的病原為石榴墊殼孢（Coniella granati）和黑曲霉（Aspergillus niger）。

據報道，石榴墊殼孢可在石榴生長期及貯藏期均可對石榴果實進行侵染。該病原易從萼筒處侵入。發病初期果實表面形成褐色病斑，中期病斑邊緣產生黃色暈圈，后期果實失水皺縮，籽粒松散，成僵果狀[18]。這與本試驗中觀察到的癥狀基本一致。黑曲霉對石榴果實的侵染則多發現于儲藏期，易從傷口處侵入。初期果實表面形成黑色病斑，中期病斑擴大，并伴有黑色霉層，后期果實發生軟腐，肉眼可見到黑色的子實體[19]。本試驗從田間的發病幼果中分離出黑曲霉，表明黑曲霉在石榴生長期也可侵入寄主潛伏，在環境適宜時即可侵染發病。

值得注意的是，在病原菌的致病性試驗中，2 種病原的致病癥狀與試驗最初采集的病果上的癥狀不一致，在回接果實發病期間并未出現與供試病果一致的規則的圓形輪紋狀病斑，但與文獻報道的癥狀相一致[20]。這可能是由于接菌方式與原先病果受侵染的方式不同造成，也可能是由于其癥狀是由石榴墊殼孢和黑曲霉共同作用所導致的結果，其具體發病機制有待進一步研究。

石榴墊殼孢和黑曲霉病原引起病害的防治已有多種成熟的手段。對于石榴墊殼孢引起病害的防治，可在越冬期間鏟除干枯的枝條及枝條上的老化翹皮，清除果園內的僵果，防止石榴墊殼孢對次年石榴果實進行再侵染；花期結束后噴施氟硅唑、腈菌唑，可有效減少石榴干腐病的發生[21]。對于黑曲霉引發病害的防治，可在果實成熟期中進行適當的通風散濕，雨后及時排水，可有效減少曲霉病的發生；在發病初期使用多菌靈或加瑞農能夠有效防止黑曲霉繼續侵染[22]。此外，通過對石榴果實進行套袋處理和除去花蕊，能有效減少病原菌的侵染，也可在果園中推廣使用。