9 種植物提取物對三七根腐病病原菌的抑菌活性測定

何曉婷，王均慧，李 嬌，魏倩倩，馮 雪，曹 揮

（山西農業大學農學院，山西太谷030801）

三七（Panax notoginseng）又名田七、金不換，屬五加科（Araliaceae）人參屬（Panaxlinn）多年生陰性草本植物，是一種傳統的中草藥[1-2]，具有重要的經濟價值及藥用價值，現已成為云南、廣西、福建等地的支柱型產業[3-4]，主要采取人工栽培和集約化的種植方式。由于長期大面積的單一種植，加之三七喜陰暖潮濕[5]，使得三七病害發生嚴重，特別是根腐病[6]，是三七生產中毀滅性的病害，嚴重影響三七種植業的發展。

三七根腐病致病因子復雜，其發生與病原菌、生長環境、施肥、灌水量適宜與否等都有重要的聯系，致使防治工作極難展開。植物保護工作者根據多年的工作經驗認為，在防治根腐病時要靈活運用“預防為主，綜合防治”的措施，如農業防治、生物防治、化學防治等措施的合理應用。農業防治中多采用輪作的方式預防根腐病的發生，但是輪作要求年限比較長，一般是8～10 a，耗費時間、人力、物力，且經濟效益不理想[7]。生物防治主要采用施用生物菌肥[8]、抑菌內生真菌[9]等措施。也有研究發現，生物質材料對三七土傳性病害具有良好的控制作用[8]。化學防治多采用化學藥劑灌根或進行土壤熏蒸等方式處理[10]，嚴重影響藥材品質，且破壞土壤結構、抑制土壤中微生物的繁殖。

目前利用植物提取物或精油防治植物病蟲害的研究逐年增多。而植物來源的天然產物既有預防作用又有治療作用，同時又具有較低的毒性和副作用[11]。近年來，研究者們非常關注從植物中分離的提取物和生物活性化合物，并分析其藥理活性[12]。GRZESIK 等[13]研究表明，植物的治療作用歸因于其所產生的次級代謝產物，主要分為生物堿、萜類和酚類。TLILI 等[14]研究了幾種突尼斯傳統芳香植物，結果表明，供試植物中顯著存在次生代謝產物，且涉及多種生物活性。

本試驗主要通過多種植物源粗提取物對三七根腐病病原菌進行抑菌活性測定，篩選出其中具有良好抑菌效果的一種或幾種，作為后續研究防治該病害的原材料。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試菌種為三七根腐病病原菌，由山西農業大學農學院植物病理實驗室提供。

供試植物材料有苦楝子（Melia azedarach Linn）、百里香（Thymus mongolicus Ronn）、甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch）、地膚子（Kochia scoparia Schrad）、決明子（Cassiae Semen）、芫花（Daphne genkwa）、瑞香狼毒（Stellera chamaejasma L.）、八角茴香（Illicium verum Hook.F.）、博落回（Macleaya cordata（Willd.））等9 種植物藥材，購自安國市聚福中藥材有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 植物提取物的提取 稱取植物粉末，按照提取物干粉與有機溶劑（工業酒精）1∶5（m/V）的量裝入廣口瓶中，充分浸泡24 h，30 ℃超聲波輔助提取30 min 后，用循環水式真空泵抽濾，將剩余濾渣收集再次進行超聲波提取，再進行抽濾，上述步驟共重復5 次，收集濾液；用旋轉蒸發儀對濾液進行減壓真空濃縮，收集濃縮液得到植物提取物原液，測定原液質量濃度后于4 ℃保存備用。

1.2.2 培養基的制備 試驗所用培養基均為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA），配制方法參考文獻[15]進行。

1.2.3 9 種植物提取物對三七根腐病病原菌菌絲生長抑菌活性的測定 采用菌絲生長速率法[16]進行抑菌活性測定。采用十字交叉法測量72、96 h 時經過9 種提取物處理的病原菌的菌落直徑（mm），根據公式計算每種植物提取物在2 mg/mL 時的抑制率。

1.2.4 苦楝子提取物對三七根腐病病原菌的毒力測定 針對三七根腐病菌，選取抑制效果最好的植物提取物，利用二倍稀釋法將苦楝子提取物配制成1、0.5、0.25、0.125、0.063 mg/mL 等5 個質量濃度，制作加藥培養基，其中，PDA 培養基為空白對照，測量24、48、72、96 h 時苦楝子提取物處理的病原菌的菌落直徑，并計算抑制率，統計分析得到不同植物提取物對病原菌的毒力方程和抑制中濃度EC50。

1.3 數據分析

運用Excel、SAS、SPSS 17.0 軟件進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 9 種植物粗提取物對三七根腐病菌的抑制效果

從表1 可以看出，通過對比分析，質量濃度為2 mg/mL 時，苦楝子提取物對三七根腐病菌菌絲生長的抑制效果最好，72、96 h 均無菌絲生長，抑制率均為100%。

表1 9 種植物提取物對三七根腐病菌菌絲生長的抑制作用

2.2 不同質量濃度苦楝子對三七根腐病病原菌的抑制效果

表2 不同質量濃度苦楝子提取物對三七根腐病菌菌絲生長的抑制作用

從表2 可以看出，苦楝子提取物隨著質量濃度的增大，對三七根腐病病原菌的抑制效果在逐漸增強，在1 mg/mL 時對三七根腐病病原菌的抑制率在60%以上，抑制作用顯著；在低質量濃度下抑制作用不顯著，抑菌效果較差。

2.3 苦楝子提取物對三七根腐病病原菌的毒力分析

選取96 h 的數據運用SAS 軟件進行統計分析，分別得出毒力回歸方程和抑制中濃度（EC50），結果顯示，苦楝子提取物對三七根腐病病原菌的毒力回歸方程為：Y＝5.449 2＋2.054 2X，根據毒力回歸方程進一步計算得出苦楝子提取物對三七根腐病病原菌的EC50為0.60 mg/mL，相關系數為0.982 1，接近于1。

2.4 苦楝子提取物對三七根腐病病原菌菌絲形態的影響

三七根腐病病原菌菌絲形態為：菌絲頂端平滑，呈蠕蟲狀，菌絲細長，菌絲內部無橫隔（圖1-A）。

在顯微鏡下觀察用藥處理96 h 后質量濃度為1 mg/mL 的菌落菌絲形態，結果表明，苦楝子提取物處理的菌絲與對照相比，菌絲頂端膨大，表面不光滑，中部出現異常突起，出現分枝、短小且縊縮，菌絲內部壁上出現黑色斑點，附著在菌絲細胞膜上（圖1-B、C）。

3 結論與討論

三七根腐病病原菌主要是病原真菌、線蟲和假單胞菌[17]。其發病機制較為復雜，發病植株癥狀最為明顯，主要表現為6 種：黃腐型、干裂型、髓爛型、濕腐型、莖基干枯型、急性青枯型[18]。作為一種土傳性病害，其常年的發病率在5%～20%，嚴重時可達70%甚至出現絕產的情況[19]，春秋季為發病高峰期[20]。

目前對于三七的研究仍主要集中在藥理方面，對于其病害防治暫無突破性進展。本試驗通過生長速率法，從9 種植物提取物中篩選出具有抑菌效果的苦楝子，發現作用96 h 后，在質量濃度為2 mg/mL下，對三七根腐病病原菌的抑制率為100%，EC50為0.60 mg/mL，并通過對菌絲形態的觀察，證實苦楝子提取物對該病原菌具有良好的抑菌活性。苦楝子提取物對菌絲的影響可能是由于逆境刺激而產生厚垣孢子和短小分枝，阻礙病原菌的生殖生長和營養生長，降低孢子產量，以達到抑菌的目的。

綠色天然的植物源殺菌劑是既對病原菌有抑菌效果，同時又能夠提高寄主的免疫力。近年來，國內外對植物源殺菌劑進行了大量研究，主要還是集中在離體環境下抑制病原菌菌絲生長和孢子萌發[21]。也有研究者發現，植物精油能夠破壞真菌生物膜系統，從而降低其穩定性，導致細胞內環境紊亂[22]。陳楚英等[23]采用牛津杯法驗證了白薇醇提物能夠使意大利青霉菌菌絲膨大、畸形，高濃度下可使菌絲斷裂、內含物消解，從而達到抑制菌絲生長的效果。本研究結果表明，苦楝子提取物能使三七根腐病病原菌菌絲膨大，出現短小且縊縮分枝。有關苦楝子提取物能否誘導三七植株防御性酶活性的提高以及抑制三七根腐病病原菌菌絲生長的分子機制還有待進一步研究。