諸葛菜不同發育時期種子脂肪酸成分分析

薛應紅，王志龍，郝月茹，鄧咪咪，薛金愛

（山西農業大學分子農業與生物能源研究所，山西太谷030801）

諸葛菜（Orychophragmus violaceus），又名二月蘭，屬于十字花科諸葛菜屬，是1 年生或2 年生草本，廣泛分布于我國東北、華北、華東、西北等地區[1-2]。諸葛菜不僅具有較強的適應性，能在房前屋后、草地、林下、荒坡種植[3-4]，還具有生長周期短、生物量大[5-6]、農藝性狀良好、抗逆性較強等特點，尤其是在華北地區寒冷的冬天仍然保持綠色不枯，因此，近年來逐漸受到許多育種專家的關注[7-9]。

諸葛菜因豐富的營養價值而成為一種多用途的作物[10]。有研究表明，諸葛菜由于其莖葉和籽粒中含有較多的蛋白質、維生素等多種營養物質，適口性較好[11-13]，可作為一種蔬菜或優質的牧草飼料[14]。諸葛菜由于其種子可以用來榨油，可作為油料作物，其育種主要集中于與油菜的雜交方面[15]，以油菜的雄性不育材料為母本，以諸葛菜為父本，進行屬間遠緣雜交育種（常規育種法），遠緣雜交中可能存在不親和現象，可采用蕾期授粉、胚挽救和子房培養[16]等方法，將諸葛菜的優良性狀轉移到油菜中,用以改良油菜的遺傳背景。研究發現，諸葛菜是一種非常珍貴的油料作物[17]，由于其種子中積累了豐富的不飽和脂肪酸[18]，尤其是對人體有益的亞油酸（18∶2），長期食用可降低人體血脂和血清膽固醇，防止血栓形成以及動脈粥樣硬化[19]，也可成為制作生物柴油和高級潤滑油的工業原材料之一[20-21]。諸葛菜作為一種綜合利用價值較高的新型油料作物，極具開發前景，然而目前有關諸葛菜種子中脂肪酸方面的研究和報道甚少。

本研究以諸葛菜為試驗材料，采集不同發育階段的果莢和種子進行形態學觀察，然后先提取脂肪酸甲酯，通過氣相色譜法分析種子中的脂肪酸組分，再提取總脂肪酸，以探究諸葛菜不同發育階段種子中脂肪酸成分和含量的變化規律，以期為后續應用代謝工程技術改造脂肪酸來增加優良脂肪酸比例，將有益人體健康的脂肪酸用于制作保健品，而另外一些具有特殊功效的脂肪酸可作為工業原料制備工業用品，以提高諸葛菜的綜合應用價值。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

諸葛菜種子采集于山西農業大學農作站試驗田，選取長勢良好且生長一致的諸葛菜，取其不同發育階段粒大飽滿的種子作為試驗材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 諸葛菜不同發育階段的果莢和種子表型采集 采集早期（開花后11 d）、中期（開花后22 d）、晚期（開花后35 d）的諸葛菜種子和果莢，種子用體視顯微鏡（40×）觀察后進行圖像采集，果莢用尺子測量后進行拍照分析。

1.2.2 諸葛菜種子脂肪酸甲酯的制備 稱取約10 mg諸葛菜種子，用液氮磨碎成粉末，加入1.5 mL 硫酸-甲醇溶液（2.5%，V/V）在試管中混合，并將試管放在恒溫水浴鍋上加熱，80 ℃溫浴90 min。將試管取出冷卻至室溫，將1 mL 0.9%的氯化鈉溶液和1 mL己烷加入管中，振蕩混勻，然后以4 000 r/min 離心15 min。抽取上清液轉移到另一個試管中，通過鼓入氮氣濃縮，在4 ℃下儲存，沉淀用50 μL 乙酸乙酯溶解，分裝到GC 瓶進行后續氣相色譜分析。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 諸葛菜種子脂肪酸成分 分別將早期、中期、晚期的諸葛菜種子研磨成粉末，并稱取10 mg樣品置于干燥玻璃試管中。參照張玲慧[22]方法進行油脂和甲酯化的分析。甲酯化脂肪酸樣品置于GC瓶中，-20 ℃保存用于氣相檢測。使用安捷倫7890B氣相色譜儀檢測TAG 中脂肪酸的成分和含量，色譜柱型號為HP-88，階梯升溫程序為：140 ℃保持5 min，然后以2 ℃/min 的速率上升至210 ℃，最后保持12.5 min；氫火焰離子化檢測器（FID）的溫度保持在250 ℃。

1.3.2 諸葛菜種子不同發育階段的總脂肪酸含量的測定 分別選取早、中、晚期的諸葛菜種子用液氮磨成的粉末，設置3 個重復，加入石英砂使之充分研磨，先后分2 次加入7.5 mL 甲醇∶氯仿（體積比為2∶1），置于37 ℃的搖床抽提24 h，離心后收集上層有機相合并，加入5 mL 氯仿、9 mL 1%的NaCl 溶液，使得氯仿∶甲醇∶H2O 體積比為2∶2∶1.8，混勻后 以8 000 r/min 離心10 min，收集下層有機相，氮氣吹干后計算脂肪酸的總質量。

1.4 數據處理

使用Excel 2010 和SPSS 23.0 軟件對數據進行整理、繪制圖表和差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 諸葛菜果莢和種子表型分析

從圖1 可以看出，諸葛菜果莢呈長角果線形，具有四棱，喙長1.1 cm。諸葛菜種子卵形或橢圓形，長度約2 mm。具體來講，早期果莢長7.4 cm，呈鮮綠色（圖1-a），種子為透明狀淡綠色（圖1-d），經過體視顯微鏡近距離觀察，發現種子為橢圓形，前端有凸出的喙，種子表面有縱條紋，條紋內有網格，網格向內凹陷，總體看來凹凸不平（圖1-g）；發育中期的果莢長度增加到9.1 cm，除了喙部區域略帶綠色，其余部位都已變成黃色（圖1-b），種子顏色也相應變為棕黃色（圖1-e），種子卵圓形，種子前端的喙變短，表面條紋間距變寬，凹陷變深（圖1-h）；生長了35 d 的晚期果莢（圖1-c）經過脫水萎縮，長度縮短為8.7 cm，總體顯黃色，種子也將近干燥，顏色加深、為深褐色（圖1-f），種子卵圓形，前端有短喙，種子脫水干燥后變緊實，為干癟狀，表面條紋間距更大，且凹凸狀更加明顯，溝壑也較深（圖1-i）。

2.2 諸葛菜種子脂肪酸組分及含量分析

諸葛菜種子中的脂肪酸有棕櫚酸（C16∶0）、硬脂酸（C18∶0）、油酸（C18∶1）、亞油酸（C18∶2）、亞麻酸（C18∶3）、二十烷酸甲酯（C20∶0）、花生烯酸（C20∶1）等。由圖2 可知，早期的諸葛菜種子中油酸和亞油酸的含量分別為18.67%和49.47%，不飽和脂肪酸含量高達76.74%；中期的諸葛菜種子中油酸含量為19.22%，亞油酸含量為48.48%，不飽和脂肪酸含量為76.21%；晚期的諸葛菜種子中油酸和亞油酸含量分別為18.38%和48.27%，不飽和脂肪酸含量為75.97%。由此可以看出，早、中、晚期諸葛菜種子中的脂肪酸含量差別不大，不飽和脂肪酸含量遠遠大于飽和脂肪酸含量，不飽和脂肪酸中含量最多的是亞油酸，油酸含量次之，飽和脂肪酸中硬脂酸和棕櫚酸含量最多。

諸葛菜是十字花科的一種，其種子中脂肪酸含量與其他十字花科植物的脂肪酸含量有一定差別，常見的十字花科植物有芥菜、芝麻菜、蘿卜、擬南芥、亞麻薺等[24]。從圖3 可以看出，芥菜中含量最多的脂肪酸是芥酸（C22∶1），占30.96%，其不飽和脂肪酸含量最高，可達92.54%，而其飽和脂肪酸棕櫚油酸和硬脂酸含量最低，其他常見脂肪酸含量差別不大；芝麻菜脂肪酸含量最高的是也是芥酸，占43.50%，其不飽和脂肪酸含量僅次于芥菜；蘿卜含量最高的脂肪酸是也是芥酸，占35.51%；擬南芥中含量最高的脂肪酸是亞油酸，占28.40%，芥酸含量（占1.88%）是最低的，其不飽和脂肪酸含量是6 種十字花科植物中最低的；亞麻薺含量最高的脂肪酸是亞麻酸，占31.86%，芥酸（3.03%）、硬脂酸和油酸含量相對較低[24]。

諸葛菜種子中的脂肪酸組成結構與上述芥菜等5 種十字花科植物的脂肪酸組成結構是一致的，都是飽和脂肪酸含量較低，不飽和脂肪酸含量較高，但是具體的脂肪酸含量有一定的區別。從棕櫚酸的比例來看，諸葛菜種子中的棕櫚酸要比其他5 種植物的棕櫚酸都高得多；從硬脂酸所占比例來看，除了擬南芥與諸葛菜相近，其余4 種植物都比諸葛菜低；從油酸所占比例來看，只有蘿卜和擬南芥與諸葛菜相差不多，其余3 種都比諸葛菜低；從亞油酸所占比例來看，諸葛菜要比其他5 種都高，其他5 種植物中芝麻菜比例最低，擬南芥比例最高；從亞麻酸所占比例來看，諸葛菜要比其他5 種植物都低，其中，亞麻薺的亞麻酸比例遠高于諸葛菜種子中的亞麻酸；從花生烯酸的比例來看，諸葛菜要比其他5 種植物都低，其他5 種植物中擬南芥的比例最高；從芥酸的比例來看，芥菜、芝麻菜和蘿卜中含量最高的就是芥酸，擬南芥和亞麻薺中芥酸含量很少，諸葛菜種子中幾乎不含芥酸。

2.3 諸葛菜種子不同發育階段的總脂肪酸含量分析

諸葛菜早期種子中每1g種子含總脂肪酸0.25 g，中期種子中每1 g 種子含總脂肪酸0.35 g，晚期種子中每1 g 種子含總脂肪酸0.40 g，由此可以看出，諸葛菜種子早期總脂肪酸含量最低，晚期總脂肪酸含量最高，總脂肪酸的含量隨著種子發育時間的增加而顯著升高，從早期到中期增加速度較快，后期增加趨勢較為緩慢（圖4）。單因素方差分析表明，諸葛菜種子早、中、晚3 個時期的總脂肪酸含量差異顯著（P＜0.05）。

3 結論與討論

諸葛菜是一種綜合價值較高的新型油料作物，其早、中、晚3 個時期種子的脂肪酸組成和含量變化較小。脂肪酸組成主要包括飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸2 類，飽和脂肪酸主要有棕櫚酸和硬脂酸，其中，棕櫚酸的含量最高，占到飽和脂肪酸的58%左右；不飽和脂肪酸有油酸、亞油酸、亞麻酸，其中，亞油酸含量最高，占到不飽和脂肪酸的63%左右。諸葛菜種子的飽和脂肪酸含量比大部分十字花科植物要高。其種子的總脂肪酸含量隨著時間的變化逐漸升高，呈增長趨勢，并且早、中、晚3 個時期的總脂肪酸含量差異顯著（P＜0.05）。研究諸葛菜不同發育階段內種子中脂肪酸成分和含量的變化規律發現，諸葛菜是一個高亞油酸低芥酸的種質，可用于開發對人體健康有益的保健品等。本研究所得結果與孫小芹等[24]、馬密霞等[25]的結果是一致的，飽和脂肪酸的含量低于不飽和脂肪酸的含量。諸葛菜種子油的經濟價值取決于其脂肪酸的組成和含量，除了充分利用諸葛菜種子油的高亞油酸，還可以開發另一種脂肪酸——棕櫚酸，諸葛菜種子油棕櫚酸含量可達12%以上，這將為生產生物柴油開發原料來源。

諸葛菜作為一種新型油料作物，具有很大的開發潛力和廣闊的應用前景。本研究通過對諸葛菜不同發育時期的種子進行脂肪酸成分含量的測定，為提高諸葛菜和其他油料作物經濟、藥用或工業價值奠定了一定的理論基礎。