轉新型抗蟲基因Vip3A 棉花的獲得及抗蟲性鑒定

肖娟麗，羅曉麗，王志安，張安紅

（山西省農業科學院棉花研究所，山西運城044000）

棉花作為一種自然纖維、植物蛋白和食用油的重要來源，具有非常重要的社會價值和經濟價值。棉花蟲害是導致棉花產量和品質下降的主要因素，給棉農造成重大的經濟損失。轉Bt Cry1Ab/c 基因抗蟲棉的推廣應用很好的控制了害蟲的危害，取得了巨大的生態和經濟效益[1]。隨著單一殺蟲基因抗蟲棉種植面積的擴大和種植時間的延長，棉鈴蟲對Cry1Ab/c 抗蟲基因產生抗性的風險也逐漸增加[2]。因此，通過發掘不同殺蟲機理的Bt 殺蟲基因，創制含有不同殺蟲機理抗蟲棉花新材料，可以緩解害蟲對單一轉基因抗蟲棉產生的抗性，并延長轉Cry1Ab/c 基因抗蟲棉的使用壽命，是解決這一問題較為經濟、安全的有效措施[3-4]。

Vip3A 類殺蟲蛋白是在蘇云金芽孢桿菌（Bt）營養生長期所產生的蛋白，它不形成晶體，不同于Bt芽孢形成期產生的晶體毒蛋白。它與Cry 類殺蟲晶體蛋白的氨基酸序列同源性極低，是一類廣譜殺蟲蛋白。Vip3A 殺蟲蛋白對鱗翅目、鞘翅目及同翅目等多種害蟲具有極高的殺蟲活性，為一類新型的殺蟲蛋白[5]。

本研究通過農桿菌介導獲得轉基因抗蟲棉Vip3A 材料，對這些材料進行目的基因PCR 分子檢測、蛋白酶聯免疫檢測和室內抗蟲性檢測等，分析目的基因Vip3A 轉入棉花受體中的表達情況和抗蟲性，為棉花抗蟲育種提供新的材料。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗所用轉基因受體材料為冀合713，由山西省農業科學院棉花研究所生物技術研究室提供。所用的表達載體用植物第一密碼子改造的蘇云金芽孢桿菌營養期殺蟲蛋白Vip3A，人工合成改造后的Vip3A 和葉綠體、線粒體信號肽（TS）序列并進行融合，構建了植物表達載體pBTVip（圖1），由中國科學院微生物研究所提供。

1.2 轉基因棉花的卡那霉素篩選和PCR 分子檢測

1.2.1 轉基因棉花的卡那霉素篩選 本試驗所用的轉化受體為冀合713，利用農桿菌介導法[6]進行棉花的遺傳轉化。轉基因棉花植株通過嫁接成活后，待葉片長出2 片真葉時，對頂部幼嫩葉片中部涂抹1 600 mg/L 醫用卡那霉素，5d 后觀察葉片的反應情況[7]。

1.2.2 轉基因棉花的PCR 分子檢測 對卡那霉素抗性轉Vip3A 基因材料及對照葉片進行DNA 提取，以轉化受體冀合713 為陰性對照，以含有目的片段的質粒為陽性對照，進行PCR 擴增。

參考CTAB 法提取棉花總的DNA[8]，設計Vip3A基因檢測引物P1：5′-CTCCACTGACGTAAGGGAT GACGC-3′；P2：5′-ATCATCGCAAGACCGGCAACA GG-3′，預計這對引物應擴增出506 bp 左右的片段。PCR 反應體系為25 μL，體系中各個反應底物按標準PCR 要求，終濃度分別是：1 PCR buffer（含Mg2+），0.075 mmol/L dNTP，1 μmol/L primer，20 ng 棉花總DNA，1 U Taq 酶/管。PCR 擴增條件是：95 ℃預變性3 min；94 ℃變性50 s，58 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，32 個循環；最后72 ℃延伸5 min，反應完后4 ℃保存待用。

1.3 轉基因棉花蛋白表達檢測

結合PCR 檢測和農藝性狀調查，對獲得的轉基因植株進行ELISA 鑒定。在苗期、蕾期、初花期、盛花期、鈴期、吐絮期取棉花頂部幼嫩葉片進行蛋白表達檢測。初花期選擇根、莖、葉、花進行蛋白表達檢測，收獲后選取完全成熟的種子進行蛋白表達檢測。取棉花組織50 mg 左右，用液氮研磨后加入提取緩沖液（1 mmol/L PMSF，0.1%（m/V）NaCl，1 mol/L Leupeptin，0.05%（V/V）Tween-20，50 mmol/LNa2CO3，pH 值9.5，0.05%（V/V）巰基乙醇），混勻后10 000 r/min 離心10 min。取上清液用于蛋白檢測。采取雙抗夾心法，用包被液（50 mmol/L Na2CO3，0.02%（m/V）NaN3）包被一抗，一抗為雞抗B.t.血清（1∶2 500），二抗用鼠抗B.t.血清（1∶1 000），酶聯抗體用羊抗鼠的堿性磷酸酯酶標記的IgG，抗體稀釋用磷酸緩沖液PBST（40 g/L NaCl，4.4 g/L KH2PO4，29.1 g/L Na2HPO4·12H2O，0.5 mL/LTween-20，pH 值7.2～7.4），用1 mg/mL 對硝基苯磷酸二鈉顯色15～30 min，405 nm 測紫外線吸收值。用Bio-Rad protein assay kit 測定蛋白濃度，對照用轉基因受體棉花的葉片，用大腸原核誘導的Vip3A 蛋白作標準曲線，計算Vip3A 蛋白的表達量[9]。

1.4 轉基因棉花室內抗蟲試驗

溫室內嫁接成活的轉基因棉花開花時，取棉株頂部倒二幼嫩葉片，放入有濕潤濾紙的試管內，每管接3 條2 日齡棉鈴蟲，用棉塞封口，在25～28 ℃條件下培養[10]。4 d 以后參照文獻[11]檢測葉片的取食情況和蟲的死亡情況及大小。

2 結果與分析

2.1 轉基因棉花的獲得和選育

以冀合713 為轉化受體，利用農桿菌介導法進行棉花遺傳轉化，共獲得32 株T0 轉基因再生植株。卡那霉素篩選表明，25 個再生植株葉片涂抹部位沒有出現顏色變化，為卡那霉素陰性植株；有7 株棉花葉片涂抹部位呈現黃色，為卡那霉素陽性植株。

在檢測的25 株轉基因植株中，有22 個轉基因樣品擴增出506 bp 特異性條帶，且與陽性對照質粒條帶大小相同，而陰性對照沒有擴增出目的條帶，因此，表明目的基因已經轉入棉花中（圖2）。

2.2 轉基因棉花植株的Vip3A 蛋白表達分析

通過總蛋白的ELISA 檢測，3 個轉基因棉花株系Vip3A蛋白的表達都是葉中表達量最高，其次為根和莖，在花和種子中的表達最低，但是3 個株系的同一組織之間的表達差異顯著（圖3）。

3 個轉基因棉花株系Vip3A蛋白的表達都是在苗期的表達量最高，蕾期、初花期、盛花期、鈴期不斷下降，吐絮期表達最低（圖4）。

2.3 轉基因棉花的抗蟲性分析

從圖5 可以看出，非轉基因對照植株葉片被大面積取食，而3 個轉基因植株BV01、BV02、BV03 葉片上只有一些被食孔，但不多；轉基因3 個植株BV01、BV02、BV03 葉片對2 代棉鈴蟲抗性的校正死亡率分別為85.7%、83.2%、86.6%，與正對照晉棉50（轉Cry1Ac 基因棉花品種）相比，無顯著差異，3 個轉Vip3A 基因植株對棉鈴蟲幼蟲都具有較高的抗性。

3 結論與討論

轉基因抗蟲棉自1997 年商業化種植以來，有效地控制了棉鈴蟲的種群，增加了有益天敵的數量，減少了農藥的使用，取得了顯著的效益。雖然轉基因棉花的推廣應用有效的控制了棉鈴蟲的危害，但是我國轉基因抗蟲棉抗性基因型單一、品種繁多、抗蟲性參差不齊，隨著種植時間的延長轉基因抗蟲棉有可能對棉鈴蟲產生抗性[12-14]。山西省農業科學院棉花研究所生物技術室轉基因課題組通過對轉Vip3A 基因棉花的3 個植株分析，發現其對棉鈴蟲有較高抗性，可為棉花抗蟲育種提供一個新型的抗性基因。

鑒于其與商業上推廣的轉基因抗蟲棉所表達的殺蟲晶體蛋白沒有交互抗性，對哺乳動物沒有危害，國內關于轉Vip3A 基因抗蟲棉未見報道，因此培育和推廣新的轉基因抗蟲棉具有極大的應用價值[15-17]。目前，本課題組已對該基因進行了安全評價相關試驗，正申報該基因在山西省的環境釋放[18]。下一步將繼續進行轉基因株系的自交擴繁及嚴格的篩選鑒定，為抗蟲棉花新品種的研發和大面積種植提供材料。