一種新型Cry1Bd 蛋白及其原核表達

錢紅梅，郭俊佩，劉小瓊，歐陽春平，高建華

（山西農業大學生命科學學院，山西太谷030801）

蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是革蘭氏陽性菌，能夠在不同的生長時期產生不同種類的殺蟲蛋白。比如，對數生長中期可以分泌外毒素，其被稱為營養期殺蟲蛋白（Vegetative insecticidal proteins，VIPs）[1]；芽孢形成的時候會產生殺蟲晶體蛋白（Insecticidal cystal proteins，ICPs）[2]。其中，研究最早，最廣泛的是殺蟲晶體蛋白，其可分為Cry（Crystal protein，晶體毒素）和Cyt（Cytolitic protein，細胞裂解素）兩大類。Bt 殺蟲蛋白的廣譜性，使其成為農業研究和生產中關注的熱點。

從第一個cry 基因cry1Aa1[3]被克隆之后，Cry 蛋白被相繼發現[4]。為便于對眾多Cry 蛋白進行歸類和研究，人們建立了Cry 蛋白分類和命名的規則[3]。Cry 蛋白的表達模式、基本空間結構和殺蟲機制等均已被深入研究[5-9]。目前，多種Cry 蛋白已被成功用于轉基因抗蟲作物，例如Cry1A 蛋白在棉花中表達，可有效地減少棉鈴蟲的侵害[10]；Cry1Ac 和Cry1C蛋白在花椰菜中同時表達，可使花椰菜中小菜蛾的抗性推遲[11]；在棉花中表達Cry2Ab 蛋白，能夠使棉鈴蟲停止攝食，從而饑餓至死[12]；Cry1Ia 蛋白能夠毒害鱗翅目和鞘翅目的昆蟲[13]；同時，Cry1Ia 也是少有的能夠在大腸桿菌中可溶性表達的Cry 蛋白[14]。因此，不斷篩選新的Cry 蛋白能夠為農業生產提供更多的抗蟲資源。

Cry1B 是Cry1 類蛋白的一個分支，其分子質量大小約為140 ku，與傳統的Cry 蛋白一樣都具有3個經典結構域，且這3 個結構域與殺蟲活性密切相關[5-9]。通過結構域的交換獲得新的殺蟲譜或改變殺蟲活性，是Cry 蛋白常見的改造方式[15]。目前，已知的Cry1B 蛋白有10 個亞類，分別是Cry1Ba、Cry1Bb、Cry1Bc、Cry1Bd、Cry1Be、Cry1Bf、Cry1Bg、Cry1Bh、Cry1Bi 和Cry1Bj[4]。

本研究以山西農業大學雜糧分子育種團隊前期篩選并克隆的一個新的cry1Bd 基因（命名為new-cry1Bd）為研究對象，首先分析了該基因編碼蛋白new-Cry1Bd 與Cry1B 系列蛋白的親緣關系，然后將cry1Bd 基因克隆至pHT304 質粒，并檢測其蛋白表達；另外，將new-Cry1Bd蛋白N 端部分進行獨立表達，檢測其表達穩定性，旨在為后續研究和利用該殺蟲蛋白奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

供試菌株為大腸桿菌（Escherichia coli）TG1 菌株和蘇云金芽孢桿菌BMB171 菌株。

試劑為TaKaRa primeSTARRHS DNA Polymerase with GC Buffer（貨號R044A）試劑盒；南京諾唯贊生物科技有限公司重組試劑盒ClonExpressRII One Step Cloning Kit（貨號c112-02）；中科瑞泰的1 kb Plus DNA ladder（貨號RTM418）；AxyGEN 質粒小提試劑盒（貨號AP-MN-P-250G）和DNA 回收試劑盒（貨號AP-GX-50G）；Thermo 的限制性內切酶BamHI、SacI、KpnI、EcoRI 和蛋白質標準分子量PageRuler Prestained Protein Ladder。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 氨基酸多序列比對構建進化樹 從NCBI 網站上下載Cry1B 蛋白家族中12 個蛋白（Cry1Ba、Cry1Bb、Cry1Bc、Cry1Be、Cry1Bf、Cry1Bg、Cry1Bh、Cry1Bi 和Cry1Bj 以及3 種Cry1Bd 蛋白）的氨基酸序列，使用Mega X 將new-Cry1Bd 蛋白序列與這12 個蛋白的氨基酸序列進行聚類分析（Neighbor joining 法）[16-17]。

1.2.2 表達載體的構建 首先，用BamHI 和SacI雙酶切p304-2Ab-1I 質粒[18]，用DNA 回收試劑盒回收相應載體片段。以新分離鑒定的new-cry1Bd基因作模板，用引物1Ball-CDS-R（5′- ACCTGAGT TTGCCTCGAGCTCCTATTCTTCCATGAGGAATAGT TC-3′）和1B-CDS-F（5′-TAAAAGAGATGGAGGG GATCCACCATGACTTCAAATAGGAAAAATG-3′）進行PCR 擴增，獲得相應的目的基因；然后通過重組克隆將目的基因克隆至上述線性化載體中，并轉化大腸桿菌TG1 菌株；通過酶切鑒定，將正確的質粒命名為p304-new-cry1Bd，含有該質粒的大腸桿菌命名為T304-new-cry1Bd；以p304-new-cry1Bd 為模板，用引物1B-CDS-F（5′-TAAAAGAGATGGAGGG GATCCACCATGACTTCAAATAGGAAAAATG-3′）和1-half-R-new（5′-TAAACCTGAGTTTGCCTCGAGC TCTTATAAGTTTCTTTCATCACTGA-3′）擴增Cry1Bd蛋白N 端編碼序列，并用相同的方法克隆至上述線性化的p304-2Ab-1I 載體中，將該質粒命名為p304-new-cry1Bdhalf，含有該質粒的大腸桿菌命名為T304-new-cry1Bdhalf。

1.2.3 2 種蛋白的表達與可溶性分析 將成功構建的2 個表達載體和pHT304 質粒，用電擊法分別轉入蘇云金芽孢桿菌BMB171 感受態細胞[19-20]；用涂布平板法平鋪到含有25 μg/mL 紅霉素的固體LB培養基上，28.5 ℃過夜培養；分別將這3 個菌株的單克隆接種于3 mL 液體LB 培養基（含有25 μg/mL的紅霉素），28.5 ℃過夜培養72 h。每個試管各取2 mL 菌液，12 000 r/min 離心10 min，分離上清和沉淀。向沉淀中加入800 μL Na2CO3溶液（50 mmol/L Na2CO3，10 mmol/L DTT，pH 值為10.5），放入37 ℃恒溫搖床，200 r/min 振蕩1 h；然后12 000 r/min 4 ℃離心20 min，分離上清和沉淀。所有上清用3 ku 的超濾管超濾至160 μL。沉淀用160 μLPBS（137 mmol/L的NaCl、2.7 mmol/L的KCl、10 mmol/L 的Na2HPO4、2 mmol/L的KH2PO4，pH 值7.4）重懸。所有樣品中，加40 μL 的5×Protein loading buffer，沸煮10 min；然后，12 000 r/min 離心5 min，上樣，進行SDS-PAGE電泳，并分析蛋白表達及可溶性。

2 結果與分析

2.1 new-Cry1Bd 蛋白親緣關系分析

將new-Cry1Bd 蛋白與12 種Cry1B 蛋白進行親緣關系分析，結果發現（圖1），new-Cry1Bd 蛋白與Cry1Bd 蛋白更接近，將該蛋白與Cry1Bd1 進行氨基酸序列比對，結果發現有3 處差異（圖2），即Cry1Bd1 蛋白第572 位為絲氨酸（S），而new-Cry1Bd中變成亮氨酸（L）；第1 147 位氨基酸由谷氨酸（E）變成天冬氨酸（D）；第1 227 位氨基酸由亮氨酸（L）變成苯丙氨酸（F）。其中，L572 位于Cry1B 蛋白的結構域III（Domain III），另外2 個差異位點位于其C 端尾部，推測對其殺蟲活性影響不大。

2.2 載體的構建及鑒定

將new-Cry1Bd 蛋白的編碼序列接入pHT304載體，并置于cry1Ac 基因的啟動子（Pac）和終止子（Tac）調控之下（圖3-A）。同時，為了研究該蛋白N端的表達穩定性，將其編碼序列也接入pHT304 載體，并由Pac和Tac調控其表達。對這2 個質粒進行限制性內切酶酶切鑒定，結果顯示，產物圖譜與預期一致（圖3-B）。

2.3 2 個蛋白的表達和可溶性分析

將含有p304-new-cry1Bd 或p304-new-cry1Bdhalf 的Bt 菌株培養72 h 后，檢測其蛋白表達情況，同時對其表達產物的可溶性進行分析，結果顯示（圖4），new-Cry1Bd 和new-Cry1Bdhalf 蛋白均能表達，且其大小均與預期一致，分別為139.7、80.8 ku。

對new-Cry1Bd 和new-Cry1Bdhalf 這2 種蛋白的表達產物進行可溶性試驗，結果顯示，2 種蛋白的表達產物均能部分溶解于堿性Na2CO3溶液，其中，完整的new-Cry1Bd 溶解比例高于new-Cry1Bdhalf。

3 結論與討論

前期，我們篩選了8 種新型cry1B 基因[21]。本研究又獲得一種新的Cry1B 蛋白（new-Cry1Bd），通過將其與其他Cry1B 家族代表比較親緣關系，結果發現，該蛋白與Cry1Bd 蛋白最為相似。將該蛋白氨基酸序列與3 種Cry1Bd 分支進行深入比對，結果發現，相比Cry1Bd1 蛋白，new-Cry1Bd 蛋白僅有3 個差異氨基酸。其中，1 個位于N 端結構域III 區域（L572），另外2 個位于C 端尾部（D1147 和F1227）。其中，位于N 端結構域III 的差異氨基酸L572，在其他已知的3 種Cry1Bd 蛋白中相對保守，均為絲氨酸，但這2 種氨基酸性質差異較大，因此，可能對該蛋白的活性或穩定性產生一定的影響；位于C 端的2 個差異位點在3 種已知的Cry1Bd 蛋白中也較為保守，但是由于C 端不參與Cry 蛋白殺蟲活性[4-8]，因此，推測這2 處的氨基酸差異與new-Cry1Bd 殺蟲活性無關。

為了進一步研究new-Cry1Bd 蛋白的殺蟲活性和應用潛力，本研究構建了該蛋白及其N 端編碼序列（Cry1Bdhalf）的表達載體，并將這2 種載體分別轉化Bt 菌株進行目的蛋白的表達，結果顯示，不論完整的new-Cry1Bd 還是其N 端多肽，均能夠在Bt細胞中表達，但這2 種表達產物的可溶性差異較大，約1/2 左右的new-Cry1Bd 蛋白可以溶于堿性Na2CO3溶液，而僅有很少比例的new-Cry1Bdhalf 可以溶解。結果說明，Cry1Bd 蛋白的C 端對其表達產物的結構具有較大的影響，這與其他Cry 蛋白一致[3，5]。

綜上所述，本研究報道了一種新型的Cry1Bd蛋白，該蛋白與Cry1Bd1 的親緣關系最近，僅有3 個氨基酸差異。該蛋白的發現為Cry1Bd 分支增添了新成員，更為重要的是，new-Cry1Bd 在其執行殺蟲活性的N 端部分僅1 個氨基酸差異。因此，該蛋白也可以直接作為1 個點突變體研究Cry1Bd 系列蛋白的殺蟲機制。