雨生紅球藻HaeDGAT2-3 的分子克隆和生物信息學分析

張宏江，趙春超，許文鑫，杭 偉，崔紅利，李潤植

（山西農(nóng)業(yè)大學分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，山西太谷030801）

化石能源的過度開采以及煤炭、石油等的大量使用是造成化石能源枯竭、全球氣候變暖的主要原因。溫室效應的“罪魁禍首”CO2是植物光合作用所必需的底物材料，光合作用過程中，綠色植物可以在光能作用下，將所吸收的CO2和空氣中的水分轉化成碳水化合物并且釋放出O2。微藻是一種誕生于億萬年前并且普遍存在于地球上的光合自養(yǎng)綠色植物[1]，它可以利用光合作用高效吸收CO2，并將其轉化為對人類有益的高附加值活性成分，如高蛋白、多糖、蝦青素和生物柴油等[2-4]。近年來，微藻由于其具有光合效率高、繁殖速度快、生長周期短等優(yōu)點，被認為是解決能源危機和治理環(huán)境污染問題的最佳選擇。

三酰甘油（TAGs）是真核生物能量儲存的主要形式，同時也是生物柴油原材料的理想來源[5]。植物體內(nèi)的TAGs 合成主要有2 種途徑：一種是乙酰輔酶A（acyl-CoA）依賴型，也稱肯尼迪途徑；另一種是不依賴于乙酰輔酶A 的代謝途徑[6]。其中，肯尼迪途徑中TAGs 的合成主要是在3 種酰基轉移酶的作用下將底物acyl-CoA 順序酰基化到甘油分子（Glycerol-3-phosphate）sn-1、sn-2、sn-3 位點的過程[7]。這3 種酰基轉移酶依次為甘油三磷酸酰基轉移酶（Glycerol-3-phosphateacyltransferase，GPAT）、溶血磷脂酸酰基轉移酶（Lyso-phosphatidic acidacyltransferase，LPAT）和二酰甘油酰基轉移酶（Diacylglycerol acyltransferase，DGAT）[8]。其中，DGAT 將酰基CoA 上的酰基部分轉移到二酰基甘油（DAG）的sn-3 位置，從而完成TAGs 的最終合成，是TAGs 合成過程中的唯一關鍵限速酶[9-10]。目前，根據(jù)DGAT功能域、亞細胞定位等差異將其分為4 種類型：DGAT1、DGAT2、DGAT3 和WS/DGAT[11-12]。其中，DGAT1 和DGAT2 是結合在內(nèi)質網(wǎng)上并編碼內(nèi)嵌于膜酯雙分子層的微粒體酶，二者具有不同的拓撲結構；而DGAG3 和WS/DGAT 是最近剛發(fā)現(xiàn)的具有DGAT 活性的酶，DGAT3 是一種可溶性酶，WS/DGAT 除了具有DGAT 活性外還具有催化臘酯（Wax ester）合成的活性[12-13]。

雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）是一種單細胞真核綠藻，在脅迫條件下（如高溫、高光和N脅迫等），雨生紅球藻細胞形態(tài)由快速生長的綠色營養(yǎng)細胞轉變?yōu)榧t色厚壁孢子狀態(tài)[14-15]，此時蝦青素在藻細胞內(nèi)大量積累以抵御不良環(huán)境。天然蝦青素具有極強的抗氧化性，抗氧化能力是維生素C 的65 倍，是β- 胡蘿卜素的54 倍[16]。相較于其他產(chǎn)蝦青素來源（紅法夫酵母、南極磷蝦等），雨生紅球藻具有生長速度快、蝦青素產(chǎn)量高（達細胞干質量的4%）等優(yōu)點，是公認的天然蝦青素的理想來源[17]；此外，其還可以有效清除氧自由基[17]，具有延緩衰老的功效，目前已被廣泛應用于化妝品、食品等行業(yè)。

雨生紅球藻中蝦青素主要以蝦青素單酯和蝦青素雙酯的形式存在，少量以游離形式存在。有研究表明，雨生紅球藻受到外界脅迫時，油脂含量會隨之增加[18]。超微結構顯示，雨生紅球藻產(chǎn)生的蝦青素酯在蝦青素積累期儲存于富含TAGs 的油體中[18]。有研究表明[19]，DGAT 可能是催化蝦青素酯化的關鍵酶。此外，萊茵衣藻、三角褐指藻和小球藻來源的DGAT 都具有恢復DGAT 缺陷型酵母H1246菌株合成三酰甘油能力的活性[20-21]。然而，雨生紅球藻中的DGAT 目前尚未見報道。

本研究以同源克隆的方法獲得雨生紅球藻中DGAT 基因，并利用生物信息學手段對其理化性質、高級結構和系統(tǒng)進化關系進行分析，以期為雨生紅球藻蝦青素酯化問題研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗藻種及培養(yǎng)條件 試驗所用藻種為雨生紅球藻Flotow 1844（購自Dunstaffnage Marine Laboratory），現(xiàn)保存于山西農(nóng)業(yè)大學分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所。所用藻種培養(yǎng)基為BG11 培養(yǎng)基，藻種培養(yǎng)于人工氣候培養(yǎng)箱，培養(yǎng)條件設置為溫度（23±1）℃、光/ 暗周期12 h/12 h、白天光照強度1 400 lx，并且每8 h 搖晃一次。

1.1.2 試驗設備 研究所用儀器為：高壓蒸汽滅菌鍋Panasonic MLS-3781L（日本松下電器產(chǎn)業(yè)株氏會社）；超凈工作臺Boxun BJ-CD（上海博迅實業(yè)有限公司）；人工氣候培養(yǎng)箱BIC-400（上海博訊實業(yè)有限公司）；電泳儀JY-SPCT（北京君意東方電泳設備有限公司）；凝膠成像儀、PCR 儀BIO-RAD（伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品（上海）有限公司）；分光光度計Nano Drop 2000（美國賽默飛世爾科技公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA 的提取及cDNA 的獲得 雨生紅球藻總RNA 通過TRizol 法提取[22]，并根據(jù)所提取的雨生紅球藻RNA 的濃度利用反轉錄試劑盒（Prime-ScriptTMRT）獲得cDNA 模板。為避免實驗過程中樣品污染，操作人員應佩戴口罩及頭套，所用離心管均為提取RNA 專用離心管。另外，將所提取的RNA保存于-80 ℃冰箱。

1.2.2 同源克隆及RACE 擴增 對來自萊茵衣藻CC3491、小球藻ATCC 30412 以及三角褐指藻的DGAT2 進行序列比對，從而獲得高度保守序列；在此基礎上，利用CODEHOP 軟件進行設計雨生紅球藻DGAT2 的2 段同源克隆引物（F1、R1 和F2、R2）。以獲得的雨生紅球藻cDNA 為模板，按照TaKaRa LA TaqR擴增體系進行PCR 擴增，從而獲得雨生紅球藻HaeDGAT2-3 的同源克隆片段。RACE cDNA 模板的制備按照試劑盒（SMARTerTMRACE cDNA Amplication Kit）說明書進行。在同源克隆片段的基礎上獲得5′端和3′端引物（5′RACE R3、R4 和3′RACE F3、F4）。以RACE cDNA 為PCR擴增模板，以5′端和3′端引物為PCR 擴增引物獲得目的基因兩端（5′端和3′端）的片段。通過DNAStar SeqMan 軟件對中間以及5′端和3′端RACE 片段進行拼接獲得雨生紅球藻HaeDGAT 基因cDNA 序列全長，并據(jù)此設計表達框引物（F5、R5）。所用引物信息如表1 所示，均由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 引物信息

1.3 生物信息學分析

雨生紅球藻HaeDGAT2-3 氨基酸序列是通過序列處理在線工具包（SMS）（http：//www.bio-soft.net/sms/），將獲得的HaeDGAT2-3 的核苷酸翻譯而來，開放閱讀框的查找是通過在線ORFfinder 軟件（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）對目的基因進行；通過在線軟件ProtParam（http ：//web.expasy.org/protparam/）對雨生紅球藻HaeDGAT2-3 的理化性質進行分析；跨膜域及疏水區(qū)的預測是通過在線軟件TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）及ProtScale（http ：//web.expasy.org/protscale/）進行；雨生紅球藻HaeDGAT2-3 及其他物種來源的DGAT2 蛋白保守功能域通過NCBI 的CCD 在線軟件（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）進行預測；二級結構及三級結構的預測分別通過SOPMA（http：//metadatabase.org/wiki/SOPMA） 和 SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）進行；多序列比對是通過本地軟件BioEdit 進行分析；系統(tǒng)進化樹是通過Clustal W 軟件進行序列比對，再通過本地軟件MEGA 7.0 進行繪制，最終通過在線軟件EvolView（https：//www.evolgenius.info/）進行修飾。

2 結果與分析

2.1 總RNA 的提取和基因克隆結果分析

由圖1 可知，泳道1 從上往下依次是28SrRNA、18S rRNA 和5S rRNA 等3 個條帶，其中，28S rRNA、18S rRNA 條帶帶型清晰，5S rRNA 條帶較模糊，說明所提RNA 質量較好；NanoDorp 2000 測定總RNA濃度是850 ng/μL，A260/A280及A260/A230值分別為1.8～2.0 和1.9～2.0，說明所提RNA 質量較好，可進行后續(xù)試驗；泳道2 和3 大小分別為482、773 bp；泳道4和5 大小分別為667、1 149 bp。

2.2 雨生紅球藻HaeDGAT2-3 蛋白cDNA 序列分析

雨生紅球藻2 型二酰甘油酰基轉移酶DGAT2（HaeDGAT2-3）的cDNA 序列全長是在同源克隆的基礎上利用RACE （rapid-amplification of cDNA ends）技術獲得，NCBI 注冊號為MN073496。如圖2所示，HaeDGAT2-3 序列全長為1 446 bp，編碼區(qū)從248～1 396 bp 共1 149 bp，編碼383 個氨基酸，其中，5′端非編碼區(qū)（5′-UTR）和3′端非編碼區(qū)（3′-UTR） 長度分別為247、49 bp。利用NCBI 中的BLASTp 程序對HaeDGAT2-3 氨基酸序列進行比對分析，結果發(fā)現(xiàn)，HaeDGAT2-3 基因與衣藻來源的DGAT2 基因（NCBI 檢索號為GAX79066.1）相似性最大（54.02%），與小球藻、月牙藻來源的DGAT2 基因（NCBI 檢索號分別為QBG05555.1、GBF91693.1）相似性分別達45.08%和41.82%。

2.3 雨生紅球藻HaeDGAT2-3 蛋白理化性質分析

雨生紅球藻HaeDGAT2-3 蛋白基本理化性質通過在線軟件ExPASY 中的ProtParam 工具進行分析，結果顯示，該蛋白分子式為C1844H2824N486O489S17，分子質量為40.17 ku，理論等電點為9.36，屬于堿性蛋白。編碼HaeDGAT2-3 蛋白的20 種氨基酸中丙氨酸（Ala）含量最高（13.3%）；其次為亮氨酸（Leu）和絲氨酸（Ser），含量分別為10.6%和7.6%；而色氨酸（Trp）和半胱氨酸（Cys）含量偏低，均為1.6%。說明該蛋白屬于不穩(wěn)定蛋白。在線分析軟件ProtScale 分析結果顯示，HaeDGAT2-3 蛋白存在至少3 個疏水區(qū)，屬于疏水蛋白。

2.4 雨生紅球藻HaeDGAT2-3 蛋白的高級結構分析

雨生紅球藻HaeDGAT2-3 蛋白的二級結構通過在線軟件SOPMA 進行分析，結果顯示（圖3-A），目的蛋白中無規(guī)則卷曲所占比例最高（44.87%），其次為α- 螺旋（32.88%），延伸鏈和β- 折疊分別占18.75%和5.71%。圖3-B 為雨生紅球藻DGAT2 的三級結構預測結果，圖3-C 為三級結構所參照模型。

雨生紅球藻HaeDGAT2-3 與其他不同來源DGAT2 蛋白的保守域通過NCBI 的在線工具進行預測，結果顯示（圖4-A），同其他來源的DGAT2 相同，HaeDGAT2-3 基因也有DGAT 基因的典型LPLAT 家族，暗示HaeDGAT2-3 具有與其他來源DGAT2 蛋白相似的功能；利用在線分析軟件TMHMMServer 對雨生紅球藻HaeDGAT2-3 與其他不同來源DGAT2 蛋白的跨膜域進行預測，結果顯示（圖4-B），HaeDGAT2-3 蛋白在40—90 位氨基酸區(qū)間內(nèi)有2 個明顯的跨膜域；對其他來源DGAT2 蛋白的跨膜域進行分析表明，DGAT2 蛋白有1～3 個跨膜域。此外，信號肽分析結果顯示, 雨生紅球藻HaeDGAT2-3 中無信號肽存在。圖4 中DGAT2 序列相關信息如表2 所示。

表2 DGAT 基因名稱及其登錄號

2.5 雨生紅球藻HaeDGAT2-3 多序列比對分析

通過本地軟件BioEdit 對HaeDGAT2-3 氨基酸序列和其他來源的DGAT2 進行比對分析，結果顯示（圖5），HaeDGAT2-3 氨基酸序列中共包含7 個保守的功能基序，分別為YFP、PH、PR、GGE、RGFA、VPFG 和G 基序。在YFP 基序中，所有序列前2 個氨基酸皆為YF，而只有HaeDGAT2-3、AtDGAT2、CzDGAT2D 等7 個序列在第3 個氨基酸位置上為苯丙氨酸（Phe）；在PH 基序中，只有CzDGAT2D、CrDGAT2D、AtDGAT2 和GmDGAT2 等4 個序列第3 個氨基酸位置上的甘氨酸（Gly，G）被絲氨酸（Ser，S）所取代，暗示這4 個氨基酸序列在功能上相似；在PR 基序中，雨生紅球藻來源的HaeDGAT2-3 氨基酸序列同高等植物來源的DGAT（AtDGAT2 和GmDGAT2）在第1 個位置上的氨基酸保持一致，第2 個位置上的氨基酸在所測試序列中散亂分布，只有氨基酸序列相對特殊的微擬球藻來源的NoDGAT2K 在第4 個位置上的氨基酸是甘氨酸（Gly，G），其余全都是精氨酸（Arg，R）；在GGE 基序中，所有序列都含有完整的GGE 基序，但是在2 個位置上的氨基酸并不保守，而只有CzDGAT2D、CrDGAT2D、AtDGAT2 和GmDGAT2 這4 個氨基酸序列在這2 個位置上的氨基酸保持一致，再一次暗示其功能相似；在基序RGFA 中，雨生紅球藻HaeDGAT2-3 異亮氨酸（Ile，I）替換了苯丙氨酸（Phe，F(xiàn)），這可能是造成功能差異的關鍵原因；VPFG 基序相比其他基序有很大的差異性，相對不保守；在基序G 中，所有氨基酸序列都有完整的G 基序，相對保守。從圖5 的分析結果可以看出，HaeDGAT2- 3 與CrDGAT2A、CzDGAT2A和CzDGAT2B可能具有相同的功能。

2.6 雨生紅球藻HaeDGAT2-3 的系統(tǒng)進化分析

為進一步研究雨生紅球藻來源的HaeDGAT2-3與其他來源DGAT 的進化關系，從NCBI 數(shù)據(jù)庫以及已發(fā)表的文獻中搜集到53 條DGAT 序列，包括微藻、菌類和高等植物來源的DGAT1s、DGAT2s、DGAT3s 和WS/DGATs 等4 種不同類型的二酰甘油酰基轉移酶，在序列比對的基礎上對其進行系統(tǒng)進化分析，結果顯示（圖6），4 種不同類型的DGATs分別聚為一支，而且微藻、菌類和高等植物來源的DGAT 在各自的類群中明顯分開；值得注意的是，HaeDGAT2-3 與CrDGAT2A、CzDGAT2A和CzDGAT 2B聚為一個小支，暗示它們具有相同的功能，進一步驗證了多序列比對的預測結果。圖6 進化樹所有序列的相關信息列于表2。

3 結論與討論

雨生紅球藻是一種單細胞綠色微藻，被認為是天然蝦青素的理想來源[5]，并且其產(chǎn)生的蝦青素以蝦青素單酯和蝦青素雙酯的形式存儲于富三酰甘油（TAGs）的油體中。二酰甘油酰基轉移酶（DGAT）是依賴于乙酰輔酶A（acyl-CoA）合成TAG 的肯尼迪途徑中催化TAG 生物合成最后一步的關鍵限速酶[9-10]，目前，已有大量來源于不同物種（包括高等植物、微藻和真菌）的DGAT 被用來探究DGAT 的表達與脂肪酸含量及成分的變化關系，研究發(fā)現(xiàn)，高等植物中續(xù)隨子來源的EiDGAT2 基因可以提高煙草葉片中的總脂含量[23]，紫蘇來源的PfDGAT1 被發(fā)現(xiàn)可以恢復TAG 缺陷型酵母H1246 重新合成油脂的能力[24]；高山被包霉來源的MaDGAT 基因以及毛霉菌來源的McDGAT 基因被證實具有恢復H1246合成油脂的能力，但它們有著不同的底物偏好性[25-26]；此外，萊茵衣藻、微擬球藻、三角褐指藻等微藻來源的DGAT 也相繼被發(fā)現(xiàn)具有催化TAG 合成的能力[5，21，27]。然而，雨生紅球藻來源的DGAT2 并未見報道。

本研究通過同源克隆方法獲得了雨生紅球藻DGAT2 的同源片段及同源克隆引物，并在此基礎上通過RACE 擴增技術獲得雨生紅球藻HaeDGAT2-3的cDNA 序列全長1 446 bp，編碼383 個氨基酸，其中，丙氨酸（Ala）含量最高，為13.3%。此外，雨生紅球藻HaeDGAT2-3 蛋白分子質量為40.17 ku，理論等電點為9.36。二級結構分析結果顯示，無規(guī)則卷曲所占比例最高，為44.87%。根據(jù)NCBI中的BLASTp分析結果顯示，雨生紅球藻來源的DGAT2 與萊茵衣藻、小球藻和月牙藻來源的DGAT2 相似性均在40%以上，分別達54.02%、45.08%和41.82%，說明其功能具有相似性。DGAT1s 和DGAT2s 雖然在分子結構上有很大的差異，屬于2 個不同的基因家族，但在功能水平上卻是一致的。DGAT1s 一般具有8～9 個跨膜域，而DGAT2s 中跨膜域相對較少，一般為1～3 個。比如，紫蘇、小球藻來源的DGAT1 都有9 個跨膜螺旋區(qū)[27-28]，續(xù)隨子來源的DGAT2 有2 個跨膜區(qū)[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，HaeDGAT2-3 蛋白具有2 個跨膜區(qū)，符合DGAT2 家族序列特點。保守域分析結果顯示，雨生紅球藻來源的DGAT2 具有同其他DGAT2來源相同的LPLAT 家族。

此外，本研究對HaeDGAT2-3 與微藻、高等植物和細菌來源的DGAT 進行多序列比對，結果表明，同其他物種來源的DGAT2 相同，HaeDGAT2-3也具有7 個功能域；在這7 個功能域中，YFP、RGFA和VPFG 基序的保守性較低。同時，CzDGAT2D、CrDGAT2D、AtDGAT2 和GmDGAT2 這4 個氨基酸序列具有很高的相似性。值得注意的是，在第5 個基序RGFA 中，HaeDGAT2-3 蛋白中異亮氨酸（Ile，I）替換了苯丙氨酸（Phe，F(xiàn)），暗示HaeDGAT2-3 基因可能具有不同的功能。系統(tǒng)進化分析結果表明，HaeDGAT2-3 基因確實屬于DGAT2 家族，并且與CrDGAT2A、CzDGAT2A 和CzDGAT2B 聚為同一個小支，暗示其具有相同的功能。

本研究在同源克隆的基礎上利用RACE 擴增技術首次獲得了雨生紅球藻中2 型二酰甘油酰基轉移酶DGAT2 的cDNA 序列全長，并利用生物信息學方法對其進行分析，結果顯示，HaeDGAT2-3 蛋白分子式為C1844H2824N486O489S17，分子質量為40.17 ku，編碼區(qū)全長1 149 bp，共編碼383 個氨基酸。功能域分析表明，其可能具有催化TAG 合成的功能。同其他來源的DGAT2 相同，HaeDGAT2-3 也具有7 個保守的功能域，而在RGFA 基序中，HaeDGAT2-3表現(xiàn)出一定的特異性，暗示其功能可能不盡相同。進化樹分析結果表明，其與已經(jīng)報道的具有TAG合成功能的DGAT2 相似性極高，暗示其可能亦具有合成TAG 的功能。本試驗結果可為進一步了解雨生紅球藻中蝦青素酯化機制提供參考。