燕麥籽粒皮裸性相關AP2/ERF 轉錄因子基因的克隆

張鳴凡，陳志偉，賈舉慶，張曉軍，李 欣，張春來，張美俊，楊武德

（1.山西農業大學農學院，山西太谷030801；2.山西省農業科學院作物科學研究所，作物遺傳與分子改良山西省重點實驗室，農業部黃土高原作物基因資源與種質創制重點實驗室，山西太原030031）

燕麥屬禾本科燕麥屬一年生草本植物，是世界各地廣泛栽培種植的一種糧、經、飼、藥、草多用途作物[1]，具有耐寒抗旱、耐瘠薄、耐適度鹽堿、不與水稻小麥等其他禾谷類作物爭奪耕地以及農業風險系數低等優良性狀[2]。燕麥品種可根據外稃形態學差異分為皮燕麥與裸燕麥2 種類型[3]。皮燕麥和裸燕麥的區別主要在于成熟后籽粒外包裹的谷殼是否容易與籽粒分離，其中，皮燕麥的外稃為革質，質地堅硬，緊貼穎果；而裸燕麥的外稃為膜質，質地柔軟，容易與穎果分離。與皮燕麥相比，裸燕麥籽粒成熟時的小穗外穎薄且脆，與護穎類似，手搓易與穎果分開[4]。

籽粒皮裸性即為籽粒帶殼與籽粒不帶殼（裸粒）的一對相對性狀，研究該性狀對作物育種、起源馴化具有重要作用。盡管大麥等禾本科植物都有籽粒帶殼與裸粒2 種類型，但控制籽粒皮裸性的機制不完全一致[4]。在大麥中，根據圖位克隆確定ERF轉錄因子家族基因（Nud）控制大麥籽粒皮裸性。在皮、裸大麥中擴增該目的基因發現，裸大麥的擴增片段比皮大麥的擴增片段缺失17 kb，并確認缺失的17 kb 包含了整個ERF 基因；Nud 基因與擬南芥調控脂質生物合成途徑的WIN1/SHN1 轉錄因子基因同源[5]。

燕麥尤其是六倍體裸燕麥（Avena nuda）是我國特有的物種，是世界上重要的糧食作物之一[6]。皮燕麥較裸燕麥有一定的生長優勢，尤其在抵抗外界不良環境及抗病性等方面[7]。由于二倍體燕麥較六倍體燕麥的基因組簡單，因此，本研究克隆了二倍體燕麥中的大麥Nud 同源基因的AsNud，以及分析了一個二倍體皮燕麥（CIav2921）和一個二倍體裸燕麥（CIav9008）的轉錄組數據，旨在為尋找控制燕麥籽粒皮裸性的基因提供一定參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

二倍體皮燕麥（CIav2921）、二倍體裸燕麥（CIav9008）的試驗材料來自美國種質資源庫，這2 個材料于2019 年5 月底種植在24 cm×19 cm 的花盆里。

1.2 皮、裸燕麥外稃形態觀察

在開花期取下附著于花序梗上的穗狀花序進行表型分析。從成熟的小穗中取下外穎，并用鑷子分解第一小花，將外穎、外稃和內稃從左至右擺好，置于體視顯微鏡下，選取合適的視野進行拍照觀察，每個樣品設3 個生物學重復，并應用cellSens Dimension 拍照軟件量化開花期外稃的面積。

1.3 PCR 引物設計、擴增和測序

參照天根植物DNA 提取試劑盒說明書從試驗材料的幼葉中提取基因組DNA。參照大麥Nud 基因序列，在NCBI 燕麥EST 數據庫、燕麥基因組測序數據庫中以及本試驗的轉錄組數據庫中比對燕麥基因組中已有的同源性最高的基因序列。利用Primer 3 在線軟件設計合適的PCR 引物。參照表1所示的試驗條件，在CIav2921 和CIav9008 基因組DNA 中進行目的基因擴增。擴增產物經TAE 緩沖液瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠染色觀察后，利用康為世紀Gel Extraction kit 試劑盒對擴增產物進行純化，然后采用TaKaRa pMDTM18-T Vector 試劑盒將純化后的目的基因片段與T 載體連接。將反應產物轉化到大腸桿菌JM109 感受態細胞，涂布于含有Amp 抗性的LB 固體平板上，對長出的單克隆進行陽性克隆驗證，挑選正確的單克隆菌液送至華大公司進行測序。利用BioEdit 和DNAMAN 軟件對得到的測序序列數據進行比對分析。

表1 PCR 引物序列和PCR 反應條件

1.4 系統發育分析

將目的基因所編碼的蛋白質氨基酸序列與大麥[5]、擬南芥[8]、水稻和玉米[9]中該基因編碼的同源程度較高的蛋白質氨基酸序列，在MEGA5.05[10]軟件中的ClustalW 模塊下進行多重序列比對，并利用Neighbor-Joining 算法（執行參數：Bootstrap method 1 000；Poissonmodel；Pairwise deletion）構建系統進化樹。

1.5 RNA 提取、cDNA 文庫構建及轉錄組測序分析

采用RNA 提取試劑盒提取CIav2921 和CIav9008 種子蠟熟期時花序的總RNA，檢測合格后交由諾禾致源公司進行測序分析。cDNA 文庫采用cDNA 合成試劑盒（Illumina 美國）構建，檢測合格的文庫利用HiSequTM2000（Illumina 美國）進行測序。RPKM值（每百萬reads 中來自某一基因每千堿基長度的reads 數目）＞1 且P 值＜0.05 的基因被認為是可表達的基因。每個樣品設3 個生物學重復。

1.6 數據分析

采用SPSS 和Microsoft office 2010 軟件進行數據處理及方差分析，采用Origin 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 二倍體皮、裸燕麥外稃的形態學差異分析

開花期時的CIav2921 與CIav9008 的小穗相比，穎片（Glume）的形態學沒有差異，而外稃（Lemma）卻有明顯差異，其中，裸燕麥的外稃與穎片類似，能看到清晰的葉脈，表面無光澤；皮燕麥的外稃只在近上部1/3 處能看到葉脈，表面通體泛有光澤（圖1-A、C）。成熟期皮、裸燕麥的外穎和內稃形態沒有差異，而外稃有差異，其中，裸燕麥的外稃舒展；皮燕麥的外稃彎曲，與籽粒緊密相連（圖1-B、D）。比較皮、裸燕麥外稃面積發現，裸燕麥的面積顯著大于皮燕麥的面積（圖1-E）。

2.2 AsNud 基因的分離與結構分析

將大麥Nud 基因序列放入NCBI 燕麥EST 數據庫、燕麥基因組測序數據庫以及本試驗的轉錄組數據庫中進行比對，結果在已有的燕麥基因組中找到同源性較高的4 條基因序列（GO593063.1、BMK_Unigene_060579、lcl|CTG24048、lcl|CTG76330）。其中GO593063.1 序列不完整，為一片段；將序列BMK_Unigene_060579 和GO593063.1 利用BioEdit 軟件比對后發現，二者在共有的堿基處相似性極高，遂將BMK_Unigene_060579 之后的序列拼接到序列GO593063.1 之后，成為一條拼接序列。利用Primer 3在線軟件設計出的引物擴增這5 條目的基因，經切膠回收、T 載體連接、感受態細胞轉化、陽性克隆驗證、菌液測序后，將得到的序列利用BioEdit 軟件進行比對，結果認為，序列BMK_Unigene_060579、序列GO593063.1 和拼接序列為同一條序列，記作AsNud1；序列lcl|CTG24048 和序列lcl|CTG76330 為同一條序列，記作AsNud2。

通過對AsNud 基因序列特征進行分析，研究AsNud 基因序列的遺傳多樣性，結果顯示（表2），CIav2921AsNud1 基因組的DNA 長度為744 bp、CIav9008AsNud1 基因組為744 bp、HvNud 為884 bp；CIav2921AsNud1 開放閱讀框（ORF）長度為48 bp、CIav9008AsNud1 開放閱讀框為639 bp、HvNud 為684 bp；CIav2921AsNud1 預測的基因產物包含15 個氨基酸殘基，CIav9008AsNud1 為212 個氨基酸、HvNud 為227 個氨基酸；CIav2921AsNud1 估計分子 質 量 為1.9 ku、CIav9008AsNud1 為22.8 ku、HvNud 為24.1 ku；CIav2921AsNud1 等電點為12.83、CIav9008AsNud1 為10.03、HvNud 為9.74。CIav2921 AsNud1 ORF 的GC 含量（54.17%）低于大麥HvNud ORF（65.64%）及全基因組DNA（61.20%），CIav9008 AsNud1 ORF 的GC 含量（61.19%）低于大麥HvNud ORF（65.64%） 及大麥基因組DNA（61.20%）。CIav2921AsNud1 與大麥HvNud 在基因組DNA 中核苷酸相似性為65.64%，而在ORF 與肽水平上，相似性分別為6.14%和6.17%；CIav9008AsNud1 與大麥HvNud 在基因組DNA、ORF 與肽水平上，其相似性分別為71.37%、73.68%和69.60%。

表2 HvNud 與燕麥同源基因AsNud 的同源性

CIav2921AsNud2 基因組DNA 長度為886 bp、CIav9008AsNud2 基因組為890 bp、HvNud 為884 bp，CIav2921AsNud2 開放閱讀框（ORF）長度為612 bp、CIav9008AsNud2 開放閱讀框為696 bp、HvNud 為684bp；CIav2921AsNud2 預測的基因產物包含203 個氨基酸殘基、CIav9008AsNud2 為231 個氨基酸、HvNud 為227 個氨基酸；CIav2921AsNud2 估計分子質量為21.5 ku、CIav9008AsNud2 為24.5 ku、HvNud為 24.1 ku；CIav2921AsNud2 等 電 點 為 11.49、CIav9008AsNud2 為10.03、HvNud 為9.74。CIav2921 AsNud2 ORF 的GC 含量（68.46%）高于大麥HvNud ORF（65.64%）及全基因組DNA（61.20%）；CIav9008 AsNud1 ORF 的GC 含量（67.96%）高于大麥HvNud ORF （65.64%） 及 全 基 因 組DNA （61.20%）。CIav2921AsNud2 與大麥HvNud 在基因組DNA 中核苷酸相似性為83.15%，而在ORF 與肽水平上，相似性分別為78.51%和71.74%；CIav9008AsNud2 與大麥HvNud 在基因組DNA、ORF 與肽水平上，其相似性分別為84.27%、90.13%和85.71%。

對 預 測 的CIav2921、CIav9008AsNud 和 大 麥HvNud 編碼的氨基酸序列分析發現，AsNud1 與AsNud2 基因同HvNud 一樣，都具有一些保守的序列特征，包括AP2/ERF 結構域、保守的中間基序（mm）和保守的C 末端基序（cm）；除了這幾個保守結構域外，AsNud1、AsNud2 與HvNud 又具有程度不一的差異。對比AsNud1 和AsNud2 基因在CIav2921 和CIav9008 中的差異發現，AsNud1 在二者中差異不大，而AsNud2 在二者中差異較大，特別是在C 末端。值得一提的是，CIav2921AsNud1 和CIav2921AsNud2 編碼的氨基酸有提前終止現象（AsNud1 基因在第17 位氨基酸處，AsNud2 基因在第204 位氨基酸處），而CIav9008 中則沒有此現象。（圖2-A、B）。

2.3 AsNud 同源基因的系統發育分析

大麥HvNud 基因與擬南芥WIN1/SHN1 轉錄因子基因同源，其中，擬南芥有3 個（AtWIN1/SHN1、AtSHN2 和AtSHN3）同源程度很高且參與蠟質和角質合成調控過程的基因，均屬于AP2/ERF 轉錄因子家族。將該轉錄因子下的6 個擬南芥基因（At1g15360、At5g11190、At5g25390、At5g25190、At5g67010 和At-2g20350）、同源程度很高的7 個水稻基因（Os02g1-0760、Os06g40150、Os06g08340、Os02g55380、Os04g-56150、Os02g32140 和Os04g32620）、3 個玉米基因（Zm2g085678、Zm2g111415 和Zm2g104260）、1 個西紅柿基因（LeERF1）以及根據大麥HvNud 基因同源克隆得到的2 個二倍體皮、裸燕麥基因（AsNud1和AsNud2）編碼的氨基酸序列在MEGA 5.05 軟件上經ClustalW 多序列比對，采用鄰接法（Neighborjoining，NJ）構建系統進化樹（圖3）。

從圖3 可以看出，AtWIN1/SHN1（At1g15360）、AtSHN2（At5g11190）和AtSHN3（At5g25390）在進化樹上屬于同一個分支，其中，AtWIN1/SHN1 與水稻中的Os02ERF（Os02g10760）和Os06ERF（Os06g40150）、與皮、裸燕麥中的AsNud1 和AsNud2、與玉米中的Zm2g085678 和大麥HvNud 的同源程度比較高。另外，玉米的Zm2g085678 與Os02ERF 和AsNud1 同源程度很高，同屬于一個小進化分支。Os06ERF 與HvNud 和AsNud2 同源程度很高，同屬于一個小進化分支，在該分支中，AsNud2（CIav2921）與大麥HvNud 的同源性更高。

2.4 AsNud 基因的轉錄分析

將CIav2921 和CIav9008 種子蠟熟期時花序進行轉錄組測序，基于RNA-Seq 數據，分析了AsNud1與AsNud2 在2 個材料中的表達情況，結果顯示（圖4），AsNud1 在2 個材料中都有表達，在CIav2921中的表達量（RPKM 值0.76）低于在CIav9008 中的表達量（RPKM 值1.34），但差異未達顯著水平。AsNud2 在2 個材料中也都有表達，在CIav2921 中的表達量（RPKM 值4.46）顯著高于在CIav9008 中的表達量（RPKM值0.65）。

3 結論與討論

AP2/ERF 轉錄因子是一個數目龐大的家族，因含有高度保守的AP2/ERF DNA 結合域而得名[11]。AP2/ERF 轉錄因子至少含有一個名為AP2 結構域的DNA 結合結構域，是由約60 個氨基酸殘基按照3 個β 折疊和1 個α 螺旋的方式所構成的一個典型的三維結構[12]。本研究利用大麥中的AP2/ERF 轉錄因子家族中的HvNud 基因為種子序列，采用電子克隆的方式，從二倍體皮、裸燕麥中克隆到2 條同源序列，序列分析發現，AsNud1、AsNud2 和HvNud 一樣，都存在由大約68 個保守殘基組成的被稱為AP2 結構域的DNA 結合基序[13]，因此，本試驗克隆到的AsNud1 和AsNud2 都屬于AP2/ERF 轉錄因子家族。此外，AsNud1 和AsNud2 還存在另外2 個保守的中間基序（mm）、C 末端基序（cm），這2個保守基序也同樣存在于HvNud 基因中[5]。結合轉錄組的數據，對基因的結構分析發現，AsNud 基因與大麥的HvNud 基因具有相同的基因結構，都是由2 個外顯子和1 個內含子組成。系統發育分析發現，AsNud 基因與大麥的HvNud 基因、擬南芥的WIN1/SHN1、水稻的Os02ERF 和Os06ERF、玉米的Zm2g085678 親緣關系最近。相比AsNud1，AsNud2與HvNud 的關系更近。對AsNud1 和AsNud2 序列比對發現，二者的相似性達到77%，因此，二者為旁系同源基因。

AP2/ERF 轉錄因子是植物中廣泛存在且特有的一類轉錄因子，參與調控植物生長發育及抗逆反應等生命過程。第一個AP2/ERF 轉錄因子基因在模式植物擬南芥中被分離出來，且被證實參與了花發育過程的調控[13]。其他植物中的AP2/ERF 轉錄因子也有陸續報道。本研究中克隆到的AsNud 基因，其同源基因在水稻中影響水稻的木質素含量，是轉錄抑制子，該基因可能參與植物次生細胞壁的生物學過程[9]，這與皮燕麥外稃堅硬且木質素含量高、裸燕麥外稃柔軟且木質素含量低對應一致；該基因還與擬南芥SHN/WIN 轉錄因子家族基因同源，擬南芥SHN/WIN 轉錄因子家族與蠟質和角質合成調控有關[8]，這與皮燕麥外稃平滑有光澤、裸燕麥外稃不平滑無光澤對應一致；該基因在大麥中控制大麥的皮裸性[5]。燕麥籽粒的皮裸性與大麥有相似之處又有所不同。成熟后的皮燕麥外稃質地堅硬，與籽粒緊密相連，不易與籽粒分離，而裸燕麥外稃質地柔軟，容易與籽粒分離，這點與大麥皮裸性相似，即裸大麥外稃較皮大麥外稃更易與籽粒分離。大麥開花10 d 后，皮大麥的穎果表面會出現一種黏性物質，將穎果與外稃黏附在一起[14]。大麥皮裸性由位于染色體7HL 上的單個基因位點（nud）控制[15]，裸大麥與皮大麥相比，缺失固定的17 kb ERF 基因。而在燕麥中，皮、裸燕麥雖然不存在這種缺失，但皮燕麥（CIav2921）較裸燕麥（CIav9008）會提前終止編碼。本研究表明，這種差別可能與籽粒的皮裸性相關，同時可以推測大麥與燕麥中控制皮裸性的機制不完全一致。對AsNud 基因的表達研究發現，AsNud1和AsNud2 在CIav2921（皮）和CIav9008（裸）的花器官中都有表達，但表達模式不同，其中，AsNud1在CIav2921 中的表達量低于在CIav9008 中的表達量，但差異未達顯著水平；而AsNud2 在CIav2921中的表達量顯著高于在CIav9008 中的表達量。這種旁系同源基因表達模式的差異在多種植物中都有報道[16-19]。此外，AsNud2 在CIav2921 和CIav9008 燕麥中的表達有明顯的差異，說明AsNud2 基因的調控區或上游的調控因子在該皮、裸燕麥中出現了差異，這可能是導致這2 個材料籽粒皮裸性不同的另一個原因。