耐除草劑玉米MON87427 定性PCR 檢測方法的建立

吳博澤，劉 璇，郭俊佩，許冬梅，袁建琴，高建華，史宗勇

（山西農業大學生命科學學院，山西太谷030801）

2018 年全球轉基因作物種植面積1.917 億hm2，其中，轉基因玉米約占30%[1]。轉基因生物技術誕生以來，生物安全問題相伴而生，不同國家和地區采取各具特色的轉基因生物安全管理制度，以確保人類、植物、動物、微生物和生態環境安全[2]。我國采取積極的應對措施，制訂了一系列法律法規對其進行嚴格管理。為實現有效監管，必須對相應的轉基因生物及其產品建立精準檢測方法。目前，轉基因產品檢測方法主要集中在核酸檢測和蛋白質檢測2 個方面[3]。其中，核酸檢測主要針對外源插入序列中的特殊元件或者插入序列附近的特征序列。通常，轉化體特異性檢測的靶標主要是外源插入序列與靶標物質基因組連接區域的DNA 序列。這種方法具有高度的專一性，是轉化體特異性檢測的首選方法[4]。

在眾多轉基因作物中，耐除草劑性狀的轉化體推廣面積最廣，比如，2018 年，耐除草劑性狀轉基因作物約占全球轉基因作物推廣面積的46%。目前主要的耐除草劑基因是epsps 和bar。耐除草劑玉米MON87427 是孟山都公司研發的耐草甘膦的轉基因品系，插入的外源序列包含一個根瘤農桿菌（Agrobacterium tumefaciens CP4）epsps 基因的表達框[5]。該基因編碼一種5- 烯醇式丙酮酰- 莽草酸-3- 磷酸合成酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synt hase，EPSPS），該酶對除草劑草甘膦表現出極高的耐受性，常被用作轉基因耐草甘膦性狀的篩選標記[6-9]。在MON87427 中，該基因由花椰菜花葉病毒CaMV 35S 啟動子和NOS 終止子調控表達。

據農業生物技術應用國際服務組織（ISAAA）統計，MON87427 在全球18 個國家已授權食用或飼用，在美國、加拿大等4 個國家已授權批準種植。目前，我國也已經批準該轉化體產品的進口。因此，對該轉化體在進口過程中的檢驗檢測和進入國內市場后的監督管理顯得尤為重要和迫切。

本研究以耐除草劑玉米MON87427 轉化體特異性序列為依據，建立轉化體特異性定性PCR 檢測方法，并對該方法的特異性、靈敏度、重復性進行測試，旨在為對該轉化體的安全評價、行政監管提供重要的技術支撐。

1 材料和方法

1.1 材料

耐除草劑玉米MON87427、耐除草劑玉米MON87427 受體材料由孟山都公司研發，由農業農村部科技發展中心提供相應的籽粒粉末。

其他轉基因玉米混合樣品，包含Bt176、Bt11、MON863、GA21、NK603、T25、TC1507、MON89034、59122、MIR604、MON88017 和MON810 等12 種轉基因玉米，每種轉基因玉米質量分數為1%；轉基因大豆混合樣品，包含305423、CV127、MON89788、A5547-127、A2704-12、GTS40-3-2、305423×GTS40-3-2 等7 種轉基因大豆，每種轉基因大豆質量分數為1%；轉基因棉花混合樣品包含LLCOTTON25、MON531、MON1445、MON15985 和MON88913 等5 種轉基因棉花，每種轉基因棉花質量分數為1%；轉基因油菜混合樣品，包含MS1、MS8、GT73、RF1、RF2、RF3、T45、Topas19/2 和Oxy235 等9 種轉基因油菜，每種轉基因油菜質量分數為1%；轉基因水稻混合樣品，包含TT51-1、KF-6、KMD-1、M12、KF-8、KF-2、G6H1 等7 種轉基因水稻，每種轉基因水稻質量分數為1%。非轉基因玉米樣品為大豐30。這些材料均為籽粒粉末，由農業農村部農作物生態環境安全監督檢驗測試中心（太原）提供。

1.2 試劑

本研究使用的主要分子生物學試劑為Taq DNA 聚合酶及其配套試劑，包括buffer、dNTPs 等，還有核酸標準分子量DL2000 DNA Marker（寶生物工程（大連）有限公司）；其他生化試劑包括CTAB、Tris、EDTA、瓊脂糖和無機鹽等（北京言必信科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 引物設計與篩選 使用Primer 5.0 軟件，根據耐除草劑玉米MON87427 的T-DNA 序列插入位點5′端旁側序列設計8 條引物（正反各4 條），共16對引物組合（表1）。

采用16 對引物組合，每個組合設置2 個平行，按農業部1485 號公告-4-2010 規定[10]，提取質量分數1%的MON87427 基因組DNA，檢測DNA 質量和濃度，并將DNA 稀釋到50 ng/μL 備用。

采用25 μL PCR 擴增體系：模板DNA 1.0 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，25.0 mmol/L MgCl21.5 μL，各2.5 mmol/LdNTPs2.0 μL，10 μmol/L引物各0.5 μL，1 U/μL Taq DNA 聚合酶1 μL，加ddH2O 至總反應體積25 μL。PCR 擴增程序為：94 ℃變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共進行35 次循環；72 ℃延伸7 min。

表1 設計引物信息

1.3.2 退火溫度和引物濃度優化 針對MON87427玉米候選引物，選擇56、58、60、62、64 ℃共5 個退火溫度和0.1、0.2、0.4、0.8 μmol/L 等4 個引物濃度，對PCR 反應條件和反應體系進行優化。

1.3.3 特異性和靈敏度測試 為測試本研究建立的檢測方法特異性，設置空白對照；陰性對照，質量分數為1%的MON87427 受體玉米；陽性對照，質量分數為1%的MON87427 玉米；利用篩選出來的候選引物，對1.1 中其他轉基因玉米混合樣品、轉基因大豆混合樣品、轉基因水稻混合樣品、轉基因棉花混合樣品、轉基因油菜混合樣品、非轉基因玉米樣品進行PCR 檢測，確定該引物的特異性。

將MON87427 玉米與對應的非轉基因受體玉米按質量比混合制成MON87427 質量分數分別為10%、1%、0.5%、0.1%、0.05%的混合樣品，用以確定檢測方法的靈敏度。

2 結果與分析

2.1 引物篩選結果

對16 對引物組合進行初篩，結果顯示，FA/RA（446 bp）、FA/RB（503 bp）、FA/RC（543 bp）、FA/RD（554 bp）、FB/RC（406 bp）和FB/RD（417 bp）組合擴增結果較為理想，可作為候選引物，進一步優化和篩選（圖1）。

使用上述6 個引物組合，對不同質量分數的MON87427 玉米DNA 進行PCR 擴增，結果顯示，引物組合FA/RC 的特異性和靈敏度均優于其他組合（圖2）。因此，本研究將對該引物組合進行PCR 反應條件和體系的優化。

2.2 退火溫度和引物濃度優化結果

對引物組合FA/RC 進行退火溫度和引物濃度 優化，結果表明，轉基因MON87427 玉米成分在設定條件下（引物濃度0 μmol/L 除外）均有預期擴增，但不同條件對轉基因的擴增效果存在差別，其中，0.4 μmol/L 引物濃度、58 ℃退火溫度擴增的效果最佳（圖3），以此初步建立了耐除草劑玉米MON87427轉化體特異性檢測方法。

2.3 特異性測試結果

對建立的MON87427 玉米普通PCR 定性檢測方法進行特異性測試。結果顯示，僅從質量分數1%的MON87427 玉米混合物樣品中擴增出預期DNA條帶，而在其他樣品中均未擴增出相應條帶（圖4）。結果表明，建立的MON87427 玉米檢測方法具有高度特異性。另外，該方法能夠在MON87427 玉米質量分數≥0.05%的混合樣品中穩定擴增出預期DNA 片段，表明該方法具有較高的靈敏度且重現性良好（圖5）。

3 結論與討論

本研究建立了MON87427 玉米轉化體特異性的定性PCR 檢測方法，該方法涉及的技術參數符合我國轉基因生物安全管理通用技術要求，能夠高效、精準檢測轉基因抗蟲耐除草劑玉米MON87427，具有廣泛的實用性和良好的應用前景。

隨著轉基因技術的發展，全球轉基因作物種植面積持續增長，公眾對轉基因生物安全性日益關注。相應轉基因作物的研發也迅速帶動發展轉基因作物檢測方法的研發，對農業轉基因生物及其產品實行安全評價、產品標識、生產許可、經營許可、進口許可、加工許可等制度的實施提供了重要技術支撐[10-12]。

轉基因玉米成分檢測對于玉米品種鑒定和對轉基因產品進行有效規范管理具有重要的現實意義[13]。在轉基因產品檢測過程中，PCR 技術因其特異性強、靈敏度高、重現性好，檢測成本較低的特性應用最為廣泛[14-17]。其中，轉化體特異性PCR 檢測方法以轉基因作物的旁側序列（與外源插入片段連接的受體基因組序列）與外源插入片段的連接即轉化體特異序列為檢測靶標，具有較高的特異性，是轉基因產品檢測國際通用方法之一[18]。