再生水灌溉對小麥抗氧化酶基因表達的影響

張 蕾，樓春華，李 艷，馬 寧

（1.北京市水科學(xué)技術(shù)研究院，北京100048；2.揚州大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)村水利研究院，江蘇揚州225009）

我國人均水資源量極度匱乏，再生水的有效利用能夠緩解水資源緊張的壓力。再生水灌溉是指將生活污水和工業(yè)廢水無害化處理后，用于農(nóng)業(yè)灌溉、園林灌溉等。再生水灌溉可以充分提高水資源的利用率，有效減輕淡水資源的過度開采壓力。但同時，再生水與新水仍然存在明顯差異，再生水中有機物和重金屬等成分可能會對土壤和植物產(chǎn)生影響[1]。

《北京市中長期科學(xué)和技術(shù)發(fā)展規(guī)劃綱要（2008—2020 年）》在“發(fā)展資源綜合利用技術(shù)，建設(shè)資源節(jié)約和環(huán)境友好型城市”主題中重點要求“集中突破再生水安全回用、雨洪水資源化利用以及海水淡化關(guān)鍵技術(shù)，實現(xiàn)資源化開發(fā)利用，增加可利用水資源總量”。據(jù)統(tǒng)計，2018 年，北京市全年用水量39.30 億m3，再生水利用量為10.76 億m3，再生水利用潛力仍有充分挖掘的空間。

已有研究表明，再生水灌溉處理與清水灌溉處理相比，小麥產(chǎn)量沒有顯著變化。再生水灌溉條件下，小麥籽粒中的主要品質(zhì)相關(guān)指標(biāo)含量（可溶性總糖、粗蛋白、粗淀粉、粗灰分、還原性Vc 等）均未受到顯著性影響；同時，小麥籽粒中全氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均增加10.2%，而全磷和全鉀含量則沒有明顯變化[2]。有研究也表明，再生水灌溉在一定程度上能夠提高氮的利用效率[3]。

基于再生水與新水的差異，再生水中重金屬等物質(zhì)的富集對植物生長環(huán)境而言可以看作是逆境。逆境是指不適合植物正常生存和生長的各種環(huán)境因素，長時間的逆境作用于植物體即會造成脅迫；持續(xù)在逆境中生長，植物體內(nèi)會產(chǎn)生大量的活性氧（Reactive oxygen species，ROS）。活性氧是指化學(xué)性質(zhì)活躍的含氧原子或原子團，主要有過氧化氫（H2O2）、超氧根離子（O2-）等。少量的ROS 能夠參與多種細胞機制，在植物生長代謝中發(fā)揮積極作用；而在正常生長條件下，ROS 能夠維持在一個相對穩(wěn)定的水平，多余的ROS 能夠通過植物體內(nèi)多種防御消除機制進行清除[4]。但是，當(dāng)植物處于逆境生長條件時，ROS 的產(chǎn)生與消除機制之間的平衡關(guān)系被打破，造成ROS 含量急增[5]；而ROS 長時間的積累，會造成細胞內(nèi)DNA、碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂類等物質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞，對細胞造成嚴(yán)重損傷[6]。

植物體內(nèi)具有多種酶促清除系統(tǒng)反應(yīng)來調(diào)節(jié)多余的ROS，以適應(yīng)脅迫條件。酶促清除系統(tǒng)主要包括抗壞血酸過氧化物酶（APX）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物還原酶（PrxR）等多種酶類。其中，APX 是以抗壞血酸（AsA）為電子傳遞體，通過抗壞血酸- 谷胱甘肽（AsA-GSH）循環(huán)過程清除H2O2，并生成單脫氫抗壞血酸（MDAsA），清除過程與氧化型輔酶Ⅱ（NADP）還原過程相偶聯(lián)。對ROS 酶促清除系統(tǒng)的研究發(fā)現(xiàn)，在對逆境脅迫的響應(yīng)過程中，APX 伴隨其他比如SOD、CAT 等酶類活性明顯增強[7-8]。

在對玉米的研究中發(fā)現(xiàn)，與清水灌溉相比，玉米用二級再生水灌溉后，抗氧化酶系統(tǒng)會受到一定影響；用三級再生水灌溉后，抗氧化酶系統(tǒng)受到的影響并不顯著。對大豆的研究表明，在苗期和收獲期，用再生水灌溉后，大豆抗氧化酶系統(tǒng)受到影響較小；但大豆花期，再生水灌溉卻對生長產(chǎn)生了較強的氧化脅迫作用[9]。

目前，對再生水灌溉小麥的研究主要集中在產(chǎn)量與品質(zhì)、典型污染物富集及健康風(fēng)險評價等方面，而對于再生水灌溉下植物細胞內(nèi)分子生物學(xué)方面的研究相對較少。

本研究通過對小麥根部抗氧化酶活性及相關(guān)反應(yīng)物等指標(biāo)進行測定，研究再生水灌溉下植物響應(yīng)機制，旨在為再生水灌溉的應(yīng)用與推廣提供理論支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試作物為冬小麥，小麥品種為論選518。

1.2 試驗設(shè)計

試驗地點選在北京市通州區(qū)永樂店某試驗基地。該試驗基地海拔12 m，位于北緯39°20′、東經(jīng)114°20′。冬小麥試驗期間為10 月至第2 年6 月，播種時施底肥磷酸二銨250 g/小區(qū)，行距15 cm。設(shè)置3 個處理：CK.清水灌溉；ZT.再生水灌溉；JT.清水和再生水2 種水源交替灌溉。每個處理3 次重復(fù)，試驗所用測坑均為無底，規(guī)格為3 m×2 m，面積6 m2。不同品種之間灌溉制度相同，具體灌水情況如表1所示。

表1 冬小麥試驗灌溉制度

其中，試驗所用清水取自當(dāng)?shù)氐叵滤?，再生水來自高碑店污水處理廠二級出水。經(jīng)檢測，灌溉所用的再生水水質(zhì)指標(biāo)基本符合《城市污水再生水利用農(nóng)田灌溉用水水質(zhì)》（GB 20922—2007）中基本控制指標(biāo)，指標(biāo)包括pH、懸浮物（SS）、化學(xué)需氧量（CODcr）、生化需氧量（BOD5）、重金屬等。水質(zhì)測定結(jié)果如表2 所示。

表2 灌溉用再生水水質(zhì)指標(biāo)

1.3 測定項目及方法

1.3.1 材料獲取 小麥取樣時間選在灌漿期和收獲期。從每個小區(qū)中選取位置居中、長勢均勻的數(shù)株小麥植株，將其根部從土中輕輕取出，快速剪斷并收集主根部，用鋁箔紙包裹，避免二次污染，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱待測。其中，收獲期根部樣品僅用于測定酶基因表達量。

1.3.2 酶基因表達量測定 APX 酶和SOD 酶基因表達量測定采用Real-time PCR 技術(shù)。以小麥根部樣本作為RNA 提取材料，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。

RT-PCR 引物由Primer 5.0 軟件設(shè)計，包括APX-RT-F（ATGGACTCGTGACCCTCTGA）和APXRT-R（GGATCATCCAACAATGCCTT）以 及SODRT-F（GAAAAAGTGCTTGCGTGATT）和SOD-RTR（ATATACAAAGATCCAACAGCGG）。反應(yīng)體系10 μL：包括SYBR FAST Qpcr Kit Master Mix（Universal）5 μL，正反引物各0.2 μL，cDNA 模板1 μL，ROX 校正染料0.2 μL，ddH2O 3.4 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性3 s，60 ℃退火20 s，40 個循環(huán)，每一個循環(huán)的退火階段對熒光進行實時檢測；95 ℃反應(yīng)15 s；60 ℃反應(yīng)15 s；95 ℃反應(yīng)15 s。這個過程記錄熒光信號變化，從而得出擴增產(chǎn)物的溶解曲線。每個樣品重復(fù)3 次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算測定結(jié)果與校正值，并計算平均值。對基因表達量的測定選用相對定量法（指在一定樣本中靶序列相對于另一參照樣本的量的變化，本研究以清水灌溉下基因表達量為基準(zhǔn)，對不同灌溉方式處理的樣本中的基因表達水平進行比較）。本次分析選用β-actin 作內(nèi)參基因，對目的基因的表達量進行校正。相對定量方法選擇常用的2-ΔΔCt法。

1.3.3 其他生化指標(biāo)測定 丙二醛（MDA）、脯氨酸（Pro）、過氧化氫（H2O2）、谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量測定采用南京建成生物工程研究所研制的試劑盒進行。NADP/NADPH 值的測定采用EnzyChrom NADP/NADPH Assay Kit（BioAssay）進行。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)整理和作圖分別采用WPS 和SigmaPlot 14.0 軟件進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 再生水灌溉對小麥根部細胞基本應(yīng)答的影響

丙二醛（MDA）通常用于表示細胞膜過氧化程度和植物對逆境條件反應(yīng)的強弱。從圖1 可以看出，與清水灌溉相比，再生水灌溉后，小麥根部細胞膜透性發(fā)生改變，灌漿期細胞內(nèi)MDA 含量增高，ZT處理（再生水灌溉）下根部細胞內(nèi)MDA 的含量為CK 的1.13 倍，JT 處理（清水與再生水交替灌溉）下根部細胞內(nèi)MDA 的含量為CK 的1.09 倍。

脯氨酸（Pro）含量通常用于反映逆境對植物的損傷程度和植物對逆境的抵抗力。從圖1 可以看出，再生水灌溉后，小麥根部Pro 含量在灌漿期較清水灌溉（CK）和JT（清水與再生水交替灌溉）處理略高，分別高3.69%和3.74%。Pro 含量越高，表明植物體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)越強，通過提高Pro 含量來減少在逆境脅迫中所受的損傷，同時也表明植物響應(yīng)逆境的滲透調(diào)節(jié)水平提高。

2.2 再生水灌溉對小麥根部H2O2 含量的影響

植株在逆境生長時，機體內(nèi)會產(chǎn)生大量的ROS，而H2O2為其中一種主要的活性氧。由圖2 可知，與CK（清水灌溉）和JT 處理（清水與再生水交替灌溉）相比，ZT 處理（再生水灌溉）條件下，小麥根部H2O2含量較低，為CK 的92.12%，而清水與再生水交替灌溉與清水灌溉之間沒有明顯差別。結(jié)果表明，再生水灌溉下，小麥根部清除了更多的H2O2。

2.3 再生水灌溉對小麥根部抗氧化酶基因表達的影響

從圖3 可以看出，ZT 處理（再生水灌溉）下，在灌漿期和收獲期，小麥根部清除H2O2的主要酶類APX 表達均明顯增加；將CK 處理（清水灌溉）下APX 基因表達改變倍數(shù)（2-ΔΔCt）設(shè)為1，灌漿期ZT處理（再生水灌溉）下APX 基因表達量是CK 的2.25 倍，JT 處理（清水與再生水交替灌溉）下APX基因表達量是CK 的1.35 倍；收獲期ZT 處理（再生水灌溉）下APX 基因表達量是CK 的1.51 倍，JT 處理（清水與再生水交替灌溉）下APX 基因表達量是CK 的1.25 倍。

SOD 作為清除ROS 的另一種重要酶類，再生水灌溉后也發(fā)生了變化。將CK 處理（清水灌溉）下SOD 基因表達改變倍數(shù)（2-ΔΔCt）設(shè)為1，灌漿期ZT處理（再生水灌溉）下SOD 基因表達量是CK 的1.56 倍，JT 處理（清水與再生水交替灌溉）下SOD基因表達量與CK 基本持平；收獲期ZT 處理（再生水灌溉）下SOD 基因表達量是CK 的1.41 倍，JT 處理（清水與再生水交替灌溉）下SOD 基因表達量是CK 的87.82%。

2.4 再生水灌溉對小麥輔酶蛋白含量的影響

由單脫氫抗壞血酸（MDHA）生成AsA 的過程就是以還原型輔酶Ⅱ（NADPH）為電子供體生成氧化型輔酶Ⅱ（NADP）的過程；由脫氫抗壞血酸（DHA）生成AsA 的過程就是以還原型谷胱甘肽（GSH）為底物生成氧化型谷胱甘肽（GSSG）的過程。機體對逆境的響應(yīng)過程會消耗大量的AsA，其再生過程會引起氧化型與還原型輔酶蛋白含量比值的變化。由圖4 可知，ZT 處理（再生水灌溉）下，小麥根部NADP/NADPH 的值略高于CK 和JT 處理（清水和再生水交替灌溉），而ZT 處理（再生水灌溉）和JT 處理（清水與再生水交替灌溉）下，小麥根部GSH/GSSG 的值均明顯低于CK，分別為CK 的74.65%和79.79%。

3 結(jié)論與討論

逆境條件引起的脅迫會產(chǎn)生大量的ROS，從而對植株造成損傷[10]。植物在逆境中受損傷的主要部位之一是細胞膜[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，再生水灌溉和清水與再生水交替灌溉下，根部細胞內(nèi)MDA 含量均高于清水對照。而Pro 含量，再生水灌溉較清水和清水與再生水交替灌溉略高。結(jié)果表明，再生水灌溉條件對植物來說存在與清水不同的逆境響應(yīng)。

植物遭遇逆境時會造成ROS 積累，H2O2是植物體內(nèi)主要的ROS，其含量可以反映植物受脅迫損傷的程度[12-13]。本研究結(jié)果表明，再生水灌溉下，灌漿期植物根部H2O2含量較清水和清水與再生水交替灌溉要低。對抗氧化酶APX 和SOD 的基因表達研究結(jié)果表明，再生水灌溉下，小麥APX 和SOD 基因表達均較清水灌溉有所增強。通過對比灌漿期和收獲期基因表達差異發(fā)現(xiàn)，與清水灌溉相比，再生水灌溉下APX 基因表達量在灌漿期高于收獲期，而交替灌溉下APX 基因表達量在2 個生長期增加量相近，均低于再生水灌溉。SOD 基因表達方面，再生水灌溉下表達增強，而清水與再生水交替灌溉下其表達量沒有出現(xiàn)增加趨勢，反而在收獲期略有下降。本研究結(jié)果表明，小麥根部APX 基因在再生水灌溉下，先在灌漿期出現(xiàn)明顯增強響應(yīng)，在再生水持續(xù)灌溉下，這種增強反應(yīng)逐漸降低，植物表現(xiàn)出逐漸適應(yīng)再生水灌溉條件，而SOD 基因表達與APX 基因同步增強。

AsA 的再生過程在植物抗逆響應(yīng)中起到非常關(guān)鍵的作用，對酶促清除系統(tǒng)持續(xù)消除過量H2O2的能力必不可少[14-15]。APX 消除H2O2的過程，以AsA作為電子供體，將H2O2還原成H2O，同時AsA 被氧化形成單脫氫抗壞血酸（MDHA）。而MDHA 在單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）的作用下，一部分被還原成AsA，這部分AsA 則可以再次參與H2O2的清除過程；另一部分MDHA 被氧化，形成了脫氫抗壞血酸（DHA），在脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）的作用下，DHA 又生成AsA，這一過程以還原型谷胱甘肽（GSH）為底物，反應(yīng)后產(chǎn)生氧化型谷胱甘肽（GSSG），在谷胱甘肽還原酶（GR）催化下生成GSH。綜上所述，H2O2的消除過程，與NADP/NADPH和GSH/GSSG 這2 個氧化還原對相偶聯(lián)，以維持細胞內(nèi)正常的氧化還原環(huán)境[10，16]。本研究表明，再生水灌溉下NADP/NADPH 的值變化不明顯，而再生水灌溉下GSH/GSSG 的值比清水明顯下降，清水與再生水交替灌溉條件下降幅居中，結(jié)果表明，以GSH為底物生成AsA 的過程對再生水灌溉條件的響應(yīng)更強。

據(jù)報道，水稻[17]、大豆[18]、玉米[19-20]、茄子[21]等多種植物在遇到脅迫逆境時，會表現(xiàn)出形態(tài)上和生理上的適應(yīng)性。通過本研究試驗結(jié)果得到證實，再生水灌溉的逆境脅迫刺激植物體內(nèi)H2O2的生成，但酶促清除系統(tǒng)內(nèi)APX 基因等能夠減輕ROS 對植物造成的損傷。

植物適應(yīng)逆境條件生存是一個極為復(fù)雜的調(diào)控過程，本研究結(jié)果可為再生水灌溉的機制研究與應(yīng)用提供一定科學(xué)依據(jù)。