ＵＰＬＣ－ＭＳ/ＭＳ法測定火鍋底料中三種喹噁啉類藥物

馬曉年　段海波　鄒艷麗　張秀清　梁志堅　陳俊秀

摘要：采用超高效液相色譜-串聯三重四級桿質譜同時檢測火鍋底料中3種喹噁啉藥物，樣品經過乙腈-乙酸乙酯提取后，以乙腈-0.2%甲酸作為流動相，采用多反應檢測正離子模式進行定性及定量分析。結果表明，3種喹噁啉類藥物的線性關系良好，相關系數均在0.999以上，不同濃度的平均加標回收率在66.5%～84.4%，平均相對標準偏差為6.8%～9.2%，該方法適用于火鍋底料中3種喹噁啉類藥物殘留的檢測。

關鍵詞：3-甲基喹噁啉-2-羧酸;乙酰甲喹;喹烯酮;UPLC-MS/MS;火鍋底料

中圖分類號：O657.63;TS264.2? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）03-0126-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.03.027

Determination of 3 quinoxaline drugs in hotpot seasoning by UPLC-MS/MS

MA Xiao-nian1，DUAN Hai-bo2，ZOU Yan-li3，ZHANG Xiu-qing1，LIANG Zhi-jian1，CHEN Jun-xiu1

（1.Kunming Center for Disease Control and Prevention，Kunming 650228，China;2.Yunnan Tobacco Industry Co.，Ltd. Technology Center，Kunming 650231，China;3.Chuxiong Normal University，Chuxiong 675000，Yunnan，China）

Abstract： UPLC-MS/MS was used to simultaneously detect three quinoxaline drugs in the hotpot seasoning. After the sample was extracted by acetonitrile ethyl acetate， acetonitrile-0.2% formic acid water was used as the mobile phase， and the multi reaction detection positive ion mode was used for qualitative and quantitative analysis. The results show that the linear relationship of the three quinoxaline drugs is good， the correlation coefficient is above 0.999， the average recovery of different concentration is 66.5%～84.4%， and the average relative standard deviation is 6.8%～9.2%. This method is suitable for the detection of? residual pollution in hotpot seasoning.

Key words： methyl-3-quinoxaline-2-carboxylic acid; mequindox; quinocetone; UPLC-MS/MS; hotpot seasoning

3-甲基喹噁啉-2-羧酸（MQCA）、乙酰甲喹（MEQ）、喹烯酮（QCT）均屬喹噁啉類化藥物，該類藥物可顯著促進動物生長，且具有較強的抑菌作用[1]，廣泛用于豬、牛、雞、羊的促進生長、抗菌治病。但該類化合物有較強的蓄積毒性和遺傳毒性，其在動物體內造成的殘留嚴重危害了消費者的健康。有學者對喹噁啉類藥物殘留從前處理到分析方法進行了研究[2-7]，并分析了不同種類的樣品。在前人研究工作的基礎上，本試驗對樣品前處理方法進行了優化，建立了火鍋底料中3-甲基-喹噁啉-2-羧酸（MQCA）、乙酰甲喹（MEQ）、喹烯酮（QCT）的超高效液相色譜-串聯三重四級桿質譜（UPLC-MS/MS）檢測方法。

1? 材料與方法

1.1? 儀器與試劑

QTRAP 4500質譜分析儀（美國 AB SCIEX）;Agilent 1290高效液相色譜儀（美國安捷倫）;高速冷凍離心機（湖南 赫西儀器）;振蕩器（常州金壇恒豐儀器制造有限公司）;超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）;氮吹儀（Reeko Auto EVA-30）;電子天平（METTLER，0.01 mg）;均質器。

3-甲基喹噁啉-2-羧酸（德國Dr.Ehrenstorfer GmbH），乙酰甲喹（BEIJING MANHAGE BIO-TECH CO.，LTD.），喹烯酮（德國Dr.Ehrenstorfer GmbH）;甲醇、乙酸乙酯、乙腈、甲酸均為色譜純;濃鹽酸、正己烷均為分析純;試驗用水為超純水。

1.2? 方法

1.2.1? 標準溶液的配制? 分別稱取MQCA、MEQ、QCT標準品4.30、3.30、4.10 mg，用甲醇溶解并定容至20 mL制成母液。再取MQCA、MEQ、QCT各50 μL定容至50 mL棕色容量瓶中，配成MQCA、MEQ、QCT濃度分別為215、165、205 ng/mL的標準儲備液，于-18 ℃避光保存。使用時根據需要配制適當濃度的標準使用液。

1.2.2? 樣品前處理? 稱取5.00 g（精確至0.01 g）均質后的火鍋底料樣品至50 mL離心管中，加入15 mL乙腈-乙酸乙酯（1∶1，V/V），混勻后置于（47±3） ℃水浴振搖15 min，超聲提取10 min，10 ℃ 7 000 r/min離心8 min，收集上層有機相，殘渣中再加入15 mL乙腈-乙酸乙酯（1∶1，V/V），重復上述步驟再提取1次，合并上層有機相。

向乙腈-乙酸乙酯提取后的殘渣中加入10 mL磷酸鹽緩沖液，置于（47±3） ℃水浴振搖15 min，超聲提取10 min，10 ℃ 7 000 r/min離心8 min，收集上清液與上述有機相合并。于40 ℃下氮氣吹至近干，加入1.5 mL含0.1%甲酸的20%甲醇溶液溶解殘留物，加入1 mL正己烷振蕩脫色，7 000 r/min離心8 min，除去正己烷層，下層過0.22 μm濾膜，供UPLC-MS-MS測定。

1.3? UPLC-MS/MS條件

1.3.1? UPLC條件? 色譜柱：島津Inertsil ODS-3柱（3 μm，2.1 mm×100 mm）;流動相A為0.2%甲酸-水，流動相B為乙腈，梯度洗脫程序見表1;流速0.30 mL/min，分析時間為5 min，進樣體積5 μL，柱溫30 ℃。

1.3.2? 質譜條件? 電離電壓4.5 kV;多反應檢測（MRM）;離子源溫度450 ℃;噴霧器壓力275.8 kPa;氣簾氣壓力241.325 kPa;輔助氣流速40 μL/min;其他參數見表2。

2? 結果與分析

2.1? 提取溶劑的選擇

采用各類溶劑提取動物源性食品中喹噁啉類藥物殘留已有文獻報道，常用有乙腈、甲醇、乙酸乙酯等單一溶劑體系或二相、三相溶劑體系。本研究比較了乙腈-乙酸乙酯（1∶1）、乙腈-甲醇-乙酸乙酯（1∶1∶1）、乙腈-甲醇（1∶1）、甲醇-乙酸乙酯（1∶1）、乙腈、甲醇、甲醇-水（1∶1）、乙腈-水（1∶1）的提取效果。結果表明，甲醇-水（1∶1）及乙腈-水（1∶1）的提取效果不佳，而其他溶劑體系均有一定的提取率，其中乙腈-乙酸乙酯（1∶1）及甲醇-乙酸乙酯（1∶1）提取率最高，回收率均能達75%以上。乙腈提取時，雜質相對較少，能減輕離子源的負擔。乙酸乙酯對脂溶性大的MEQ和QCT有較好的提取率，故本研究采用乙腈-乙酸乙酯（1∶1）作為提取溶劑。

2.2? 基質效應的消除

在應用LC-MS/MS測定復雜樣品（如動物源食品及生物樣本）時，基質通常對分析物的離子化具有增強或抑制效應，此為基質效應。基質效應影響儀器的靈敏度和重復性，是可靠定性及準確定量的重要影響因素。主要采用以下手段減少基質效應：①通過優化色譜分離條件使得內源性雜質與待測物分離;②保留時間靠前，比較容易受基質效應的影響，試驗適當地增加待測組分的分離時間，使之在2 min后出峰以減少基質效應;③采用較低流速使同時離子化的化合物減少，降低待測組分與基質成分在電離過程中的競爭，從而減弱基質效應;④在保證靈敏度的情況下，采用小進樣體積降低基質效應。

2.3? 流動相的選擇

本試驗有機相分別采用了甲醇、乙腈、甲醇-乙腈混合溶液，水相分別采用了含0.1%甲酸、含0.2%甲酸，將有機相和水相進行兩兩搭配進，結果發現乙腈有改善峰形的作用， 0.1%甲酸-乙腈及0.2%甲酸-乙腈均能分離測定兩個物質，但在0.2%甲酸-乙腈體系下，待測組分的響應較高且峰形窄。圖1為各流動相下的TIC圖。考慮到操作的簡便及分離的效果，試驗最終確定流動相為0.2%甲酸-乙腈。

2.4? 質譜條件的優化

根據待測物的性質，配制MEQ、MQCA、QCT濃度分別為165、215、205 μg/mL的標準溶液，在ESI+模式下分別進行質譜條件優化，第一步進行母離子掃描，確定母離子，優化得到去簇電壓和碰撞電壓。并在MRM模式下優化了氣簾氣、離子源溫度、噴霧氣、輔助加熱氣。

2.5? 方法研究及結果分析

2.5.1? 線性范圍、回歸方程和檢出限? 分別配制MQCA的質量濃度為4.3、21.5、43.0、129.0、215.0 μg/L，MEQ的質量濃度為3.3、33.0、99.0、165.0、264.0 μg/L，QCT的質量濃度為4.1、20.5、41.0、123.0、205.0 μg/L系列混合標準溶液。以目標組分的峰面積（y）對質量濃度（x）做標準曲線。3種化合物的線性關系、相關系數、方法檢出限見表3。

2.5.2? 方法回收率和精密度? 空白樣品每份5.00，共3組，分別添加7.5、15.0、30.0 ng MQCA，5.0、15.0、30.0 ng MEQ，7.5、15.0、30.0 ng QCT，測定結果見表4。從表4可以看出，不同濃度的平均加標回收率在66.5%～84.4%，平均相對標準偏差為6.8%～9.2%。圖2為標準品及加標樣品中MRM色譜。

3? 結論

建立了同時檢測火鍋底料中3-甲基喹噁啉-2-羧酸、乙酰甲喹、喹烯酮殘留的UPLC-MS/MS分析方法，通過對樣品處理條件和儀器條件進行優化，使得方法簡便、經濟。該方法操作簡單、靈敏、穩定，可滿足火鍋底料中3種喹噁啉類藥物殘留的檢測。

參考文獻：

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收稿日期：2019-06-10

基金項目：昆明市衛生人才科技人才培養項目[2017-sw（后備）-66]

作者簡介：馬曉年（1985-），女（壯族），云南臨滄人，主管技師，碩士，主要從事食品質量與安全工作，（電話）13888021164（電子信箱）179267837@qq.com;通信作者，陳俊秀（1988-），女，云南玉溪人，初級檢驗師，主要從事理化分析工作，（電子信箱）752110643@qq.com。