UPLC-MS/MS 法測定復(fù)方甘草片中甘草酸含量不確定度評定

陳高健 周日秀 湯麗昌

摘 要：本文的目的是對超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）測定復(fù)方甘草片中甘草酸的含量進行不確定度評定，通過建立不確定度評估的數(shù)學(xué)模型來對不確定度的各主要分量進行分析計算，得出合成不確定度及擴展不確定度。結(jié)果顯示，當復(fù)方甘草片中甘草酸的測定結(jié)果為49.90mg/g時，在95%的置信區(qū)間下，其擴展不確定度為7.8mg/g，k=2。因此得出結(jié)論，采用UPLC-MS/MS法測定復(fù)方甘草片中甘草酸的含量，發(fā)現(xiàn)其不確定度的主要來源為標準溶液配制與標準曲線擬合，該評估模型能夠為檢測復(fù)方甘草片中甘草酸的不確定度評估提供一定的參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法? 復(fù)方甘草片? 甘草酸? 不確定度

復(fù)方甘草片為常用復(fù)方制劑，其成分包括甘草浸膏粉、阿片粉、樟腦、八角茴香油、苯甲酸鈉等，屬于鎮(zhèn)咳祛痰類非處方藥品[1]。UPLC-MS/MS具有較好的選擇性和靈敏度，特別適用于復(fù)雜樣品的分析。事實上，其測得結(jié)果只是被測量的估計值，而完整的測量結(jié)果還應(yīng)包括被測量的估計值及不確定度[7，8]。因此，本文在建立UPLC-MS/MS法[2]測定復(fù)方甘草片中甘草酸含量的基礎(chǔ)上，根據(jù)相關(guān)的規(guī)范和指南[3，4]并參考相關(guān)文獻[5，6]對實驗結(jié)果進行不確定度評定，以期為UPLC-MS/MS法測定復(fù)方甘草片中甘草酸的含量提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1290高效液相色譜儀，美國安捷倫公司;G6460三重串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀，美國安捷倫公司;S1-T256渦旋混合器;CPX5800H-C超聲波清洗機，美國必能信上海科導(dǎo)儀器有限公司;XA205DU萬分之一電子天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司。

甘草酸對照品（批號：G-004-170414）供實驗室藥品檢驗用，成都瑞芬思生物科技有限公司;復(fù)方甘草片（批號：190202）為市售品;色譜甲醇、色譜甲酸，Thermo;超純水為Milipore 制備。

1.2 供試品溶液的制備

取復(fù)方甘草片20片，精密稱定，研細后稱取約1片量，置于100mL量瓶中，然后加入適量甲醇-水（1︰1），超聲提取處理（300W，250KHZ）30min，取出后放冷;用甲醇-水（1︰1）稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取濾液1mL置于100mL容量瓶中;用甲醇-水（1︰1）稀釋至刻度，搖勻后用0.22μm微孔濾膜濾過，取濾液即得標準供試品溶液，備用。

1.3 標準溶液的配制

精密稱取甘草酸對照品15.67mg于50mL容量瓶中，加甲醇并搖勻，作為對照品儲備溶液;精密吸取10mL儲備液，置于100mL容量瓶中，加甲醇并搖勻，作為對照品標準溶液。精密吸取對照品標準溶液1.00、2.00、5.00、10.00、20.00mL，分別置于100mL容量瓶中，然后加甲醇并稀釋至刻度，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，供UPLC-MS/MS測試。

1.4 分析條件

Agilent EclipsePlus-C18色譜柱（2.1×50mm，1.8μm）;流動相：0.1甲酸乙腈-0.1%甲酸水（70︰30，V/V）;流速：0.2mL/min;柱溫：30℃;進樣量：5μL。采用電噴霧負電離源模式（Electronic spray ion，ESI-），掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測（Multiple reaction monitoring，MRM）;霧化氣壓力：30psi;干燥氣溫度：300℃;干燥氣流速：8L/min;毛細管電壓：4000V;碎裂電壓：165V;定量離子碰撞能：45eV，定性離子碰撞能：50eV。

1.5 測量模型

甘草酸含量的計算式：

式中，X為樣品中甘草酸的含量（mg），C為供試品溶液中甘草酸質(zhì)量濃度（mg/mL），V為樣品溶液的定容體積（mL），M為樣品取樣量（g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 測量不確定度的來源

由測量模型可知，檢測過程中產(chǎn)生的不確定度主要包括樣品稱量μrel（M）、樣液定容μrel（V）、標準溶液配制μrel（C）、標準工作曲線擬合μrel（X）、樣品重復(fù)性測試μrel（rep），以及加樣回收率引入的標準不確定度μrel（R）。

2.2 各標準不確定度分量的評定

2.2.1 天平稱取試樣質(zhì)量M引入的相對標準不確定度μrel（M）的評定

稱取的試樣質(zhì)量為0.1500g。天平檢定證書上的最大允許誤差為±0.0001g，故由兩次測量組成（稱量空盤1次、盤加試樣1次），按均勻分布，取包含因子k=? ? 。

天平稱取試樣質(zhì)量的標準不確定度為：

相對標準不確定度為：

μrel（M）=8.2×10-5/0.1500=5.5×10-4。

2.2.2 試樣溶液制備的相對標準不確定度μrel（V）的評定

試樣溶液定容由100mL容量和1mL單標吸量管產(chǎn)生，使用的兩種容量器具引入的相對標準不確定度評定[7，8]結(jié)果見表1。

注：水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃-1。

樣品稀釋過程中引入的相對標準不確定度為：

2.2.3 標準工作溶液配制過程中引入的相對標準不確定度μ1，rel（C）

2.2.3.1 標準物質(zhì)引入的不確定度μ1，rel（C1）

測量所用標準物質(zhì)甘草酸的純度為98.0%，由標準物質(zhì)證書得知相對標準不確定度為±2.0%，k=2，則μ1，rel（C1）=μ（Cs）/Cs=2%/2=1.0×10-2。

2.2.3.2標準工作液稀釋過程中引入的相對標準不確定度μrel（C2）

標準工作溶液不確定度由50、100mL容量和10mL單標吸量管產(chǎn)生，對所使用容量器具引入的相對標準不確定度評定[7，8]結(jié)果見表2。

注：水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃-1。

標準工作液稀釋過程中引入的相對標準不確定度為：

2.2.3.3 標準系列溶液配制過程中引入的相對標準不確定度μ1，rel（C3）

吸取對照品溶液1.00、2.00、5.00、10.00、20.00mL，置于100mL容量瓶中，對所使用容量器具引入的標準不確定度評定[7，8]結(jié)果見表3。

2.2.4 標準工作曲線擬合時引入的相對標準不確定度μrel（X）

根據(jù)工作站及采集數(shù)據(jù)對標準工作溶液進行測量，以響應(yīng)值（A-）與濃度（C）作標準曲線得到擬合的線性回歸方程：A=a+b×C=323.4×C+73.33，其中截距a=73.33，斜率b=323.4，相關(guān)系數(shù)r=0.9999。由工作曲線擬合時引入的不確定度源于其殘差的標準差，殘差為測定值（A）與標注曲線擬合值（? ? ）之差的絕對值（|A-? ?|），殘差的計算見表4。

標準曲線殘差標準差為：

標準工作曲線擬合時引入的相對標準不確定度為：

2.2.5 重復(fù)性實驗引入的相對標準不確定度μrel（rep）的評定

取待測樣品溶液，按試樣方法分別進行6次測定，測定結(jié)果分別為49.87、50.23、48.98、50.39、51.11、48.79mg/g，平均值為49.90mg/g，標準偏差Srep=0.8823，重復(fù)性實驗相對標準不確定度為? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 。

2.2.6 添加回收率引入的不確定度μrel（R）的評定

對樣品進行6次加標回收試驗，添加水平為0.1567μg/mL，回收率分別為100.2%、99.5%、98.1%、98.2%、97.3%和98.4%，平均回收率為98.6%，標準偏差為1.050，由回收率引入的相對不確定度為? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?。

2.3 甘草酸含量的合成標準不確定度和擴展不確定度

將各項相對標準不確定度分別列于表5，計算合成標準不確定度為：

根據(jù)GB/T 27418-2017測量不確定度評定和表示法[3]，采用UPLC-MS/MS測定甘草酸含量結(jié)果的合成不確定度為U（X）=49.90×7.9×10-2=3.9mg/g，取包含因子k（95）=2，則甘草酸的擴展不確定度為Urel=2×3.9=7.8mg/g。因此，其真實結(jié)果可表示為（49.90±7.8）mg/g，k=2。

3 結(jié)論

由計算結(jié)果可知，本試驗測量不確定度的主要來源是甘草酸標準溶液配制與標準曲線擬合。因此，需要重點考慮標準溶液的配制及標準系列的稀釋過程中引入的不確定度分量。試驗應(yīng)嚴格按照操作規(guī)程，繪制好標準曲線，選擇合理的線性范圍，確保測量結(jié)果準確、可靠。經(jīng)研究，本試驗建立的不確定度評定方法可為UPLC-MS/MS測定復(fù)方甘草片中甘草酸含量提供一定的科學(xué)依據(jù)。

參考文獻：

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