國產彈性蛋白酶浸泡法構建兔腹主動脈瘤及其隨訪

畢永華，伊夢飛，陳紅梅，韓新巍，任建莊，尉澤鵬

腹主動脈瘤（abdominal aortic aneurysm，AAA）常發生于腎下腹主動脈，特征性表現為血管壁慢性炎性浸潤、彈力纖維降解及中膜變薄，但確切發病機制尚不清楚。采用彈性蛋白酶腔內灌注或氯化鈣浸泡等化學損傷法構建小型動物模型，常用于病因學和干預治療的基礎研究[1-8]。彈性蛋白酶血管腔內灌注法多見于構建嚙齒類動物模型，但建模方法操作復雜，需要經髂總動脈插管，且灌注過程中需阻斷腹主動脈血流并防止溶液滲漏。相比之下，主動脈周氯化鈣浸泡法較為簡單、易行。通過在主動脈周浸泡彈性蛋白酶溶液也可誘導AAA 形成[8-10]。White 等[9]將 腎 下 腹 主 動 脈 段 浸 泡 于20 U/μL 彈性蛋白酶溶液70 min，成功構建AAA 模型。然而Origuchi 等[10]研究發現，主動脈周彈性蛋白酶浸泡法誘導的兔AAA 存在自愈現象，術后6 周瘤體逐漸縮小，3 個月時主動脈直徑幾乎恢復正常，這與人類AAA 臨床表現不相符。此外，以往彈性蛋白酶一般浸泡2～3 h，建模時間較長，影響手術成功率。采用國產豬胰彈性蛋白酶浸泡法建模鮮見報道，我國學者也往往采用美國Sigma 公司和Calbiochem 公司彈性蛋白酶灌注法建模，價格較昂貴。本研究嘗試采用國產豬胰彈性蛋白酶并縮短浸泡時間快速構建兔AAA 模型，并隨訪長期穩定性，觀察是否也存在自愈現象，以評價其應用價值。

1 材料與方法

1.1 實驗分組

本研究遵循實驗動物保護條例和使用標準，并獲得鄭州大學動物保護和使用委員會批準。24 只雄性新西蘭白兔，平均體重（3.0±1.1） kg，隨機分成實驗組、對照組，每組各12 只。實驗組采用10 μL濃度為10 U/μL 國產豬胰彈性蛋白酶溶液浸潤主動脈近分叉處血管段30 min，對照組采用0.9%氯化鈉溶液10 μL 浸潤30 min。

1.2 AAA 模型構建

分別按0.3 mL/kg 和0.7 mL/kg 體重肌內注射速眠新Ⅱ和3%戊巴比妥溶液麻醉，兔仰臥位固定于手術臺上，腹部備皮；聚維酮碘消毒、鋪巾，沿腹白線剖腹，充分暴露腹主動脈，距分叉0.5 cm 處開始向近心端游離出長約1 cm 腹主動脈段；以套有塑料軟管彎鑷支撐，使腹主動脈游離段懸空，無需阻斷動脈血流；將大小約3 mm×4 mm 面巾紙貼于外壁上，實驗組以微量移液器滴加10 μL 彈性蛋白酶溶液（M0139，活力≥30 U/mg，上海楷洋生物技術公司），首滴為4 μL，隨后每5 min 滴注2 μL，避免溶液滲漏（圖1），對照組同法滴注0.9%氯化鈉溶液10 μL；浸泡30 min 后移去紙片，用0.9%氯化鈉溶液沖洗2 次，避免溶液殘留；逐層縫合，將兔送回籠子。

圖1 動物模型構建

1.3 觀察指標

①主動脈直徑：術前和術后5、15、40、100、150 d，分別經耳緣靜脈造影，測量主動脈內徑。留置24 G靜脈輸液針，快速推注約6 mL 對比劑。主動脈內徑較術前增大50%以上視為AAA 形成。②病理學改變：術后5、15、150 d 造影完畢兩組分別處死4 只兔，對浸泡段主動脈取材，固定于4%多聚甲醛溶液，作蘇木精-伊紅（HE）、彈力纖維EVG 染色，觀察主動脈形態學改變和彈力纖維變化。③免疫組化：同時采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結（streptavidin-perosidase，SP）法染色，觀察基質金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9和小鼠抗兔巨噬細胞抗體（rat anti-rabbit macrophage antibody，RAM）-11 表達。以1%過氧化氫孵育15 min，10%山羊血清封閉后加一抗4℃過夜。生物素化山羊抗小鼠IgG 室溫孵育20 min，二氨基聯苯胺（DAB）顯色，中性樹酯封片。

1.4 統計學分析

采用GraphPad Prism 5.0 軟件作統計學分析，數值以均數±標準差（）表示，t 檢驗分析兩組內徑變化，P＜0.05 時認為差異有統計學意義。

2 結果

主動脈直徑測量顯示，實驗組兔術后即刻可見直徑明顯增大，術后5 d 均形成AAA，術后15 d 進一步增大，顯著大于對照組兔（P＜0.000 1）；術后40 d 稍縮小，但100 d 直徑基本穩定，仍大于對照組（P＜0.05）；術后150 d 直徑明顯縮小。對照組未見AAA 形成，直徑無明顯變化（圖2）。

圖2 主動脈直徑變化趨勢

組織學分析顯示，實驗組術后5 d血管壁結構紊亂，中膜變薄，大量紅細胞滲出，伴炎性細胞浸潤，彈力纖維幾乎消失，僅可見少許殘留片段；術后15 d血管壁規則，部分管腔可見少量內膜增生和殘留的彈力纖維；術后150 d 內膜、中膜明顯增厚增厚，形態較規則，可見新生彈力纖維，但纖細、排列紊亂，與對照組規則結構有所不同。對照組動脈內膜、中膜和外膜結構完整，內、外彈力層和中膜彈力纖維層排列規整、連續，呈波浪狀，未見斷裂、碎裂（圖3）。

圖3 病理學變化

免疫組化分析顯示，實驗組術后5 d 可見殘留的平滑肌細胞表達MMP-2，伴炎性細胞浸潤，血管各層可見大量MMP-9 和RAM-11 陽性表達；術后15 d 中膜和外膜可見少量散在MMP-9、RAM-11 陽性表達，平滑肌細胞內MMP-2 呈強表達；術后150 d幾乎未見MMP-9、RAM-11 陽性表達，MMP-2 呈中度表達。對照組未見陽性細胞表達（圖4）。

圖4 免疫組化染色結果

3 討論

AAA 主要危害在于瘤體持續擴張，最終導致破裂，甚至死亡。其確切發病機制尚未完全明確，需多種AAA 模型進一步研究[2，11-12]。彈性蛋白酶腔內灌注法常用于小型動物AAA 模型構建，但建模時需要經髂總動脈插管，且灌注過程中需阻斷腹主動脈血流，并防止溶液滲漏。該建模方法復雜，手術難度大，且死亡率高、并發癥多。主動脈周浸泡彈性蛋白酶溶液也可誘導AAA 形成，但該模型3 個月時幾乎恢復正常，這與人類AAA 臨床表現不相符[5]。因此，構建一種更簡易、穩定的模型十分必要。

White 等[9]通過彈性蛋白酶浸泡法成功構建兔AAA 模型，但彈性蛋白酶一般浸泡2～3 h，建模時間較長，影響手術成功率。我國學者往往采用進口彈性蛋白酶灌注法建模，采用國產豬胰彈性蛋白酶浸泡法建模鮮見報道。本實驗采用濃度為10 U/μL國產豬胰彈性蛋白酶，只需浸潤30 min，術后5 d 即可形成動脈瘤，浸潤時間比以往研究大大縮短。與彈性蛋白酶腔內灌注方法相比，該方法無需穿刺髂動脈、阻斷血流，故簡單易行，創傷小。

Origuchi 等[10]研究提示主動脈周彈性蛋白酶誘導的動脈瘤可自行愈合，發現術后42 d 動脈逐漸縮小，90 d 時主動脈直徑幾乎恢復正常；認為平滑肌細胞不可逆性損害對動脈瘤形成是必須的。本研究發現，術后150 d 主動脈直徑明顯縮小，內膜過度增生，可見大量纖細彈力纖維再生；盡管該模型有自愈傾向，但100 d 內直徑基本保持穩定，有助于AAA機制研究，這與Origuchi等[10]報道的觀點有所不同。

本實驗結果表明，國產豬胰彈性蛋白酶溶液浸泡法可誘導兔AAA 形成。該方法操作簡單、安全、有效。該模型有自愈傾向，但100 d 內基本穩定，有助于AAA 機制等進一步研究。