基于網絡藥理學對蒲公英抑制α-葡萄糖苷酶活性成分及作用機制的研究

趙光耀,趙 坤,蔣文雯*,王道平,張 明

1貴州大學藥學院，貴陽 550025；2貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室，貴陽 550014

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種以高血糖為特征的代謝性疾病；通常將其分為I型糖尿病和II型糖尿病，絕大多數患者為II型糖尿病患者。α-葡萄糖苷酶抑制劑，因其副作用小，可以有效控制糖尿病患者餐后血糖上升，平穩血糖，常作為輔助治療II型糖尿病的首選藥物。但目前的α-葡萄糖苷酶抑制劑都存在胃腸道反應，例如：腹痛、腹瀉、胃腸脹氣等。因此本課題組想從天然產物中尋找到一種安全、毒副作用小的α-葡萄糖苷酶抑制劑來解決糖尿病人的需求[1]。

蒲公英(TaraxacummongolicumHand.-Mazz)是一種常見的一年生或兩年生菊科草本植物。具有清熱解毒、消腫散結、利尿通淋之功效，用于疔瘡腫毒、濕熱黃疸、熱淋澀痛[2-5]。近年來國內外研究證明了蒲公英具有降糖活性[6-10]，但對于蒲公英抑制α-葡萄糖苷酶的研究報道，目前尚未見報到。本實驗擬研究蒲公英是否具有抑制α-葡萄糖苷酶活性，并期望從中發現活性較強的小分子抑制劑。

1 試劑與儀器

1.1 藥材與試劑

α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase) 購自Sigma公司；4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖(4-N-trophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG)購自Sigma公司；阿卡波糖(acarbose)購自德國拜耳公司;菜油甾醇(ergost-5-enol麥角甾-5-烯醇)，β谷甾醇(β-sitosterol)均購置于道斯夫生物科技有限公司；蒲公英購于貴陽市萬東橋民族藥材市場，經貴州中醫藥大學孫慶文教授鑒定為蒲公英(TaraxacummongolicumHand.-Mazz)；其余化學試劑均為國產分析純。

1.2 儀器

FLEX超純水系統(英國Elga)；TW200酶標儀(瑞士Tecan)；恒溫培養箱(上海博泰實驗設備有限公司)；電子天平(上海良平儀器儀表有限公司)；RE-2000B型旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)，HP6890/5975C GC-MS聯用儀(美國安捷倫公司)，96孔板購自Corning Costar(美國Cambridge MA公司)。

2 試驗方法

2.1 蒲公英提取物的制備

蒲公英全草洗凈，烘干；用75%的乙醇溶液浸泡18 h，超聲波提取30 min，反復三次；得到蒲公英總提取液，濃縮干燥得到蒲公英提取物浸膏，-20 ℃保存待用。

蒲公英全草按上述方法得到藥材浸膏后，分散于水中，再分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等溶劑依次萃取3次[11]。各萃取部位濃縮干燥后，-20 ℃保存待用。

2.2 α-葡萄糖苷酶活性的檢測

α-葡萄糖苷酶活性的檢測方法采用96孔板篩選體系，反應體系參照文獻報道的方法[12]。

阿卡波糖(acarbose)為本法的陽性對照，采用SPSS17.0軟件計算半數抑制濃度(IC50)值。酶活性抑制率按下式計算：

酶活性抑制率(inhibitory rate)=(A陰性對照-A樣品校正)/(A陰性對照-A空白對照)×100%

2.3 蒲公英不同部位α-葡萄糖苷酶活性影響

將蒲公英的各個植株部位分別用75%的乙醇超聲提取；再分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取；將萃取液濃縮干燥，得到不同部位、不同極性提取物；參照“2.1”的方法進行體外活性實驗。

2.4 雙倒數法(Lineweaver-Burk)研究蒲公英活性部位的抑制類型

將蒲公英全草的石油醚部位溶解于二甲基亞砜(DMSO)中配制為100 mg/mL的溶液；將上述配好的溶液，取5 μL DMSO溶液加入495 μL PB緩沖液將每個樣品分別稀釋100倍，在α-葡萄糖苷酶活性測定的反應體系中樣品溶液的反應終濃度為10 μg/mL。同時配制以下五個濃度的PNPG溶液：1.7、2、2.5、3.3、5 mmol/mL。即使底物濃度的倒數成等差數列。在酶標儀中記錄、測量每分鐘吸光度的變化量；整理數據，繪制雙曲線倒數圖。

2.5 蒲公英提取物GC-MS的分析條件

色譜柱為FB-5MSI(30 m×0.25 mm×0.25 μm)彈性石英毛細管柱，柱溫46 ℃，保持2 min，以6 ℃/min升溫至310 ℃，保持12 min，進樣溫度250 ℃；載氣為高純He(99.999%)；柱前壓7.06 psi，載氣流量1.0 mL/min。

離子源為EI源；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；發射電流34.6 μA；倍增器電壓1 612 V；接口溫度280 ℃；質量范圍29～500 amu。NIST2005和WILEY275譜庫；不分流進樣；溶劑延遲時間：4 min。

2.6 活性成分的虛擬篩選與分子對接

將2.5實驗步驟中GC-MC的結果，選擇通過中藥系統藥理學分析平臺(TCMSP)篩選有效成分，以化合物口服生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18作為活性化合物的篩選條件，篩選出 TCMSP 中具有較高活性的化合物。通過Pubmed(醫學文獻檢索)數據庫，下載活性化合物的3D或2D結構；并用分子對接軟件AutoDockVina將化合物分子對接到α-葡萄糖苷酶的活性位點，得到相對應的化合物對接打分。

2.7 單體化合物的α-葡萄糖苷酶體外活性驗證

根據分子對接的結果，選取2種分子對接分數較高的單體化合物，按照“2.3”的實驗步驟，進行α-葡萄糖苷酶的體外活性的驗證。

2.8 基于網絡藥理學對蒲公英活性成分的降糖活性機制研究

將篩選到的有效成分經Pubmed(醫學文獻檢索)數據庫檢索得到相關靶點名，再由Universal Protein(蛋白質信息)數據庫中，轉化為標準基因；通過在Swiss target數據庫中查找靶點基因，進而采用Cytoscape 軟件構建化合物-靶點網絡圖；經Genecard 數據庫構建疾病靶點相互作用網絡圖；篩選藥物靶點和疾病靶點相互作用圖的核心靶點，利用ClueGO對核心靶點進行分析，進一步運用DAVID數據庫對網絡預測出的靶點所涉及的基因功能Gene-Ontology(GO)進行注釋分析，并對相關通路(pathway)進行KEGG 通路富集分析。

3 統計處理

4 結果

4.1 蒲公英醇提取物對α-葡萄糖苷酶活性的影響

由表1所示，蒲公英全草乙醇提取物對濃度α-葡萄糖苷酶具有良好的抑制作用，其抑制效果呈依賴性關系。蒲公英各極性萃取物溶液對α-葡萄糖苷酶均有抑制效果，其抑制效果與各萃取物溶液自身濃度呈依賴性關系；且石油醚的萃取物抑制效果尤為明顯。石油醚萃取物與陰性對照組存在顯著性差異，抑制效果強于陽性對照組阿卡波糖。

表1 蒲公英全草各提取部位對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

注：與陰性對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

Note：Compared with negative control,*P<0.05,**P<0.01.

4.2 蒲公英各部位的不同極性提取物對α-葡萄糖苷酶活性的影響

如表2所示，蒲公英的根、莖、葉、花、種子的總提取物對α-葡萄糖苷酶都具有較強的抑制作用，其中蒲公英莖的總提取液的抑制作用最強，其次是花和種子兩個部位。但單獨研究某一個極性條件下的活性抑制效果時，可以發現蒲公英的根和花在石油醚萃取部位表現出很強的抑制作用，同時隨著萃取溶劑的極性的逐漸變大，抑制效果逐漸下降，而蒲公英莖和葉則是水和正丁醇的抑制活性較好，但是沒有蒲公英的根和花的石油醚萃取部位的活性強，由此我們可以判斷蒲公英抑制α-葡萄糖苷酶主要是通過花和根的石油醚極性萃取物成份起到主要作用。

表2 蒲公英不同部位的α-葡萄糖苷酶活性的結果

4.3 蒲公英石油醚部位的抑制類型研究

如圖 1 所示，Lineweaver-Burk 雙倒曲線作圖均為相交于縱軸的一點的一組直線，隨著抑制劑蒲公英石油醚萃取物溶液濃度的增大，直線縱軸截距不變，而直線斜率逐漸增大，米氏常數Km值(橫截距為-1 /Km) 隨抑制劑濃度的增大而增大，最大反應速率Vmax(縱截距為 1 /Vmax) 保持不變，可推測石油醚部位對α-葡萄糖苷酶的抑制類型為競爭性抑制[14]。根據競爭性抑制動力學方程可求得蒲公英石油醚部位在不同加入量下表現的抑制常數 Ki = 22.915 mg/L(見圖1)。

圖1 蒲公英全草石油醚Lineweave-Burk雙倒數曲線Fig.1 Double reciprocal curve of petroleum ether Lineweave-Burk of dandelion herb

4.4 蒲公英石油醚部位化學成分GC-MS分析

采用 GC-MS對具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的石油醚部位進行鑒定分析，鑒定得到39個化合物，見圖2和表3。從表3可以看出石油醚部位的化學成分主要為脂肪酸、酮類、酯類和三萜類化合物。

圖2 蒲公英全草石油醚部位GC-MS 圖譜Fig.2 GC-MS chromatogram of petroleum ether fraction of dandelion herb

序號No.名稱Name分子式Molecular formula出峰時間Peak time(min)分子質量Molecular mass含量Content(%)1Decane 癸烷C10H229.851420.029 22,3-Dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl-4H-pyran-4-one 2,3-二氫-3,5二羥基-6-甲基-4(H)-吡喃-4-酮C6H8O413.641440.0433 Dodecane 十二烷C12H2614.951700.02243-Ethyl-4-methylpyrrole-2,5-dione 3-乙基-4-甲基吡咯-2,5-二酮C7H9NO215.821390.04053-Methyl-dodecane 3-甲基-十二烷C13H2816.871840.0666Tetradecane 十四烷C14H3019.541980.0467Indole 吲哚C15H24O22.012200.1848Dihydroactinidiolide 二氫獼猴桃(醇酸)內酯C11H16O2 22.471800.3069Lauric acid 月桂酸C12H24O2 23.012000.061102-Hydroxy-β-ionone 2-羥基-β-紫羅蘭醇C13H20O2 25.502080.124 111,15-Pentadecanediol 1,15-十五烷二醇C15H32O2 25.822440.144 12Myristic acid 豆蔻酸C14H28O2 26.742280.35013Iso-neophytadiene 異新植二烯C20H38 27.912780.40214Nephytadiene 新植二烯C20H38 28.04278 2.556156,10,14-Trimethyl-2-pentadecanone 6,10,14-二甲基-2-噁唑烷酮C18H36O28.132680.865 16Isophytol異植醇C20H40O28.762960.53317Methyl palmitate 棕櫚酸甲酯C17H34O2 29.472700.08518Butyl phthalate 苯二甲酸丁酯C16H22O4 30.142780.59919Palmitic acid 棕櫚酸C16H32O2 30.462561.39620Ethyl palmitate 棕櫚酸乙酯C18H36O2 30.592840.588

續表3(Continued Tab.3)

序號No.名稱Name分子式Molecular formula出峰時間Peak time(min)分子質量Molecular mass含量Content(%)21Nonadecane 十九烷C19H40 32.242680.329 22Phytol 葉綠醇C20H40O 32.522963.233 23Ethyl linoleate 亞油酸乙酯C20H36O2 33.213080.75524Linoleic acid 亞油酸C18H32O2 33.4328023.074 25Uncertain component未確定成份N/A 35.51N/A0.935261-Eicosano 1-類二十烷酸C20H42O 37.792980.24527Heneicosane 二十一烷C21H4437.872960.437282-Monopalmitin 2-棕櫚酸單甘油酯C19H38O438.083302.66029Cyclotetracosane 二十四環烷C24H4840.373364.180301-Docosanol正二十二醇C22H46O40.463261.575 31Lupeol acetate羽扇豆醇酸酯C32H52O241.074682.58732Uncertain component未確定成份N/A42.75N/A4.49433Uncertain component未確定成份N/A44.96N/A2.71634Vitamin E 維生素EC29H50O245.434300.44635Ergost-5-enol 麥角甾-5-烯醇C28H48O46.554001.06036Stigmasterol 豆甾醇C29H48O46.934122.51037γ-Sitosterol γ-谷甾醇C29H50O47.684145.632 38Phytyl decanoate 十三烷酸葉綠酯C30H58O247.774500.48239β-Amyrin β-香樹素C30H50O48.194264.604

4.5 活性成分的虛擬篩選與分子對接結果

將4.4中GC-MS氣相色譜鑒別出的化合物，通過TCMSP數據庫進行虛擬篩選；選擇口服利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18；作為篩選條件。(結果見表4)氣質聯用技術鑒定結果中蒲公英全草石油醚部位成分僅有五種化合物滿足成藥條件(部分化合物數據庫尚未收錄)把這五種化合物ergost-5-enol麥角甾-5-烯醇(俗稱菜油甾醇，后文中皆以菜油甾醇出現)、γ-sitosterol(γ-谷甾醇)、phytol(葉綠醇)、ethyl linoleate(亞油酸乙酯)palmitic acid(棕櫚酸)；用軟件 autodock vina軟件與α-葡萄糖苷酶進行打分；將打分結果大于7的化合物，認為其與α-葡萄糖苷酶有強結合作用；可以得出菜油甾醇與γ-谷甾醇能α-葡萄糖苷酶較其他幾種成分與α-葡萄糖苷酶有較強的結合能力(結果見圖3)。

表4 蒲公英活性成分—分子對接打分結果

圖3 活性成分的分子對接3D圖Fig.3 3D map of molecular docking of sitosterol注：A：菜油甾醇；B：γ-谷甾醇；C：β-谷甾醇。Note:A:Ergost-5-enol;B:γ-Sitosterol;C:β-Sitosterol.

4.6 單體化合物的體外活性結果

由4.5的實驗數據結果，得出結論認為ergost-5-enol麥角甾-5-烯醇(即菜油甾醇)、γ-sitosterol(γ-谷甾醇)這兩種物質能與α-葡萄糖苷酶很好的結合；可能是活性強的小分子是α-葡萄糖苷酶抑制劑。為驗證此猜想；購買這兩種單體進行體外活性實驗(注：γ-sitosterol(γ-谷甾醇)全球未有供貨商所以用β-sitosterol(β-谷甾醇)代替它實驗，也另做有β-谷甾醇與α-葡萄糖苷酶的分子對接圖3和表4)，其活性結果見表5。

表5 單體體外活性成分

4.7 基于網絡藥理學初步研究蒲公英活性成分的降糖作業機制

利用TCMSP、TCMID數據庫、PubChem等數據庫聯用檢索，將蒲公英的有效化合物逐一配對潛在靶點[15]。同時使用蛋白質數據庫(Uniprot Database)，篩選出物種為“人”的靶點，從而獲得與候選化合物相關的靶點蛋白信息。同時在TCMSP 數據庫中篩選靶點靶點對應的疾病。在genecards(基因信息最全面的網站)里面找到II型糖尿病的相關靶點。

4.7.1 篩選蒲公英活性成分的ADME參數

利用網絡藥理學分析數據庫(TCMID)和(TCMSP)搜索蒲公英化學成分，利用PubChem 數據庫(對化學成分的分子結構進行確證，最后建立蒲公英化合物數據庫。再篩選通過ADME參數篩選：以選擇口服利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18 作為化合物分子的篩選條件[16]，得到五種化合物:葉黃呋喃素、菊黃素、槲皮素、蒲公英萜醇、β-谷甾醇。

4.7.2 繪制疾病—成分靶點圖

在genecards里找到II型糖尿病靶點，取相關度大于10的靶點和成分靶點在CTD(comparative toxicogenomics database)里面做vene(韋恩)圖得到成分靶點217個和二型糖尿病靶點584個，且得到共有靶點基因78個(見圖4)。

4.7.3 繪制成分—靶點圖

表6 蒲公英活性成分篩選結果及其ADME參數表

注：數據來源：TCMID、TCMSP、PubChem數據庫。

Note：Source:TCMID,TCMSP,PubChem database.

圖4 二型糖尿病—蒲公英成分靶點基因的韋恩圖Fig.4 Type 2 diabetes-Ingredients targets gene-VennDiagram

在通過TCMSP平臺尋找蒲公英活性成分與市面上常見的幾種II型糖尿病藥物的潛在靶點，將候選化合物與II型糖尿病的靶點蛋白上傳至Cytoscape軟件生成體現蒲公英藥物-靶點相互作用的網絡圖，通過與主流藥物與蒲公英成分通過共同靶點建立聯系建立聯系(見圖5)。

以dgree(度)≧15作為篩選條件，在網絡中，一個節點的度(degree)表示網絡中和節點相連路線的條數；度越大，說明該成分與靶點相關程度越高。

圖5 蒲公英成分與降糖藥-靶點圖Fig.5 Dandelion components and hypoglycemic agents-target picture

蒲公英成分中有蒲公英萜醇、槲皮素、菊黃素、β-谷甾醇、有效成分其中槲皮素的度為149β-谷甾醇的度為37明顯高于幾種主流的II型糖尿病藥物(見表7)。說明槲皮素、β-谷甾醇等天然成分可作用于多個降糖靶點，可能具有良好的降糖作用。

4.8 PPI網絡的構建與分析

在string中輸入共有基因，設定最低交互評分為0.9，得到ppi網絡互作圖[16]得到78個節點、189條邊(圖6)。平均節點4.85.運用Bisogenet插件對網絡中所有點的拓撲參數(度、介度中心度和接近中心度)進行分析，選擇靶點中每個靶點的度拓撲參數值大于中位數，即度≥12，closeness centrality(接近中心度) ≥0.5作為篩選核心靶點的條件，篩選核心靶點Hub-蛋白。得到了3個核心靶點AKT1(蛋白激酶)、IL6(白介素-6)、TNF(腫瘤壞死因子-α)。

表7 蒲公英成分和二型糖尿病藥物降糖靶點的度值

4.9 繪制蒲公英成分與降糖藥物的疾病成分共有靶點圖

運用Cytoscape軟件繪制蒲公英成分與降糖藥物的疾病成分共有靶點圖[17](見圖7)得到87個節點110條邊.在圖中我們可以看出蒲公英成分中的蒲公英萜醇與菊黃素對II型糖尿病有著一定的聯系，β-谷甾醇具有較好作用；槲皮素有很強的降糖活性。

4.10 GO富集分析

利用DAVID平臺對蒲公英中PPI網絡中涉及的核心靶點進行GO功能富集分析。根據錯誤發現率(false discovery rate，FDR)<0.05，進一步確定了GO條目。其中包括通路、生物學過程、細胞成分、分子功能；其中通路的條目為145條，包括得有主要的降糖通路AMPK(AMP依賴的蛋白激酶)12條和PI3K-AKT13條。將其運用cytoscape繪制得到了新的靶點-通路圖(見圖8和圖9)。

圖6 蒲公英成分蛋白相互作用網絡Fig.6 Dandelion component protein interaction network

5 討論

本課題組首次研究發現黔產蒲公英全草乙醇提取液具有較強的α-葡萄糖苷酶抑制作用(見表1)，且石油醚萃取物的抑制效果最為顯著(IC50約為0.9 μg/mL)。為更好的分析石油醚萃取物中的有效成份，特選用氣相色譜-質譜聯用技術作為檢測手段；檢測出石油醚萃取的浸膏成份中共有39種化合物，其中2種未知成份。進一步對37種已知化合物進行分析，查閱相關文獻，選擇口服利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18作為篩選條件，同時對相關參數接近但有相關的文獻支撐的化合物，一并選入進行了分子對接。實驗結果得出β-谷甾醇、γ-谷甾醇、菜油甾醇對α-葡萄糖苷酶具有良好的親和性；后續的單體化合物體外活性實驗結果也證明了這個結論。

圖7 蒲公英成分與降糖藥物的疾病成分共有靶點圖Fig.7 Common target diagram of dandelion components and disease components of hypoglycemic drugs

圖8 蒲公英有效成分通路圖Fig.8 Road map of dandelion active component

通過對蒲公英全草研究后，也對蒲公英各個植株部位的抑制活性作用再次進行實驗；從中發現蒲公英中除莖外，絕大多數植株部位的低極性成分抑制效果要優于高極性成分[13]；這與之前的全草體外活性中石油醚萃取成分活性良好結果相互印證；同時，由表2可知，蒲公英根和花的石油醚萃取物具有良好的抑制效果，本課題組推測其在全草石油醚萃取物中起主導作用。蒲公英莖中的活性成分，多富集于正丁醇萃取物中；其活性效果與其他部位有差異，其莖乙醇總提取物活性是整個蒲公英植株部位中最好；但莖用各萃取劑所萃取成分活性均不如總提取液活性；說明蒲公英莖中乙醇總提取物活性是由各個極性成分的共同協同作用體現。

在對蒲公英石油醚萃取物做酶代動力學研究中，發現通過改變底物濃度；使得反應速率發生改變，但其關于縱坐標的交點幾乎保持不邊(見圖1)；可初步判斷石油醚萃取物中成分的抑制類型為競爭性抑制。結合后面實驗中的分子對接實驗結果分析，可以進一步確定蒲公英低極性成分存在可作為抑制α-葡萄糖苷酶抑制劑先導化合物。

本研究采用液相色譜-質譜聯用技術(GC-MS)對蒲公英石油醚萃取部位的化學成分進行了分析[14,15]。本研究從蒲公英石油醚部位共檢測并鑒定得到39個化合物，其中含有三種未知物質，其化學成分主要為脂肪酸、三萜類、黃酮、植物甾醇類、乙酰酯類、揮發油等。在檢測出的化合物中，葉綠醇和亞油酸乙酯、γ-谷甾醇等類化合物的降糖活性雖有降糖研究方面的報道，但目前缺乏抑制糖苷酶方面的報道[16-19]，并且我們首次發現麥角甾酮-烯醇具有較強抑制α-葡萄糖苷酶作用。

圖9 蒲公英有效成分的靶點-通路圖Fig.9 Target-pathway diagram of active components of dandelion

本文探索了黔產蒲公英抑制α-葡萄糖苷酶的活性和相關化學成分，并通過網絡藥理學初步分析了其降糖的作用機制，豐富了蒲公英植物生理活性及化學成分的內涵，提供了蒲公英開發為新的α-葡萄糖苷酶活性抑制劑或降糖藥物的實驗依據。