PubMLST數據庫克羅諾桿菌中外分離株的分型比較

王小曼，趙 煒，李詩瑤，周幗萍

（1.武漢輕工大學 生物與制藥工程學院，湖北 武漢 430023；2.南通海關監管科，江蘇 南通 226002；3.湖北省食品質量安全監督檢驗研究院，湖北 武漢 430030）

克羅諾桿菌（Cronobacter）是一種無芽孢的革蘭氏陰性條件致病菌，主要引起嚴重的新生兒腦膜炎、敗血癥及壞死性小腸結腸炎等疾病，死亡率高達40%～80%，患者痊愈后仍會有嚴重的神經系統后遺癥。HEALY B等[1]的報道顯示，一些免疫力缺陷的成人尤其是老人也會被感染，會導致如肺炎、膿毒癥、腳潰瘍、局部感染、骨髓炎、脾膿腫等疾病。但與成年人感染情況相比，5歲以下的兒童發生克羅諾桿菌的感染比例更高[2]。

分類系統將克羅諾桿菌獨立為屬，包括七個種：阪崎克羅諾桿菌（Cronobacter sakazakii）、蘇黎世克羅諾桿菌（Cronobacter turicensis）、丙二酸鹽克羅諾桿菌（Cronobacter malonaticus）、莫金斯克羅諾桿菌（Cronobacter muytjensii）、都柏林克羅諾桿菌（Cronobacter dublinensis）、康帝蒙提克克羅諾桿菌（Cronobacter condiment）、尤尼沃斯克羅諾桿菌（C.universalis）[3-4]。克羅諾桿菌存在于食品和環境中，其分離來源較為廣泛，從肉類、蔬菜、水果、谷物、牛奶、奶粉替代品、加工奶酪、水[5-7]等食品，草藥[8]、香料[9-10]以及家庭灰塵、土壤樣本等環境[11]，甚至在果蠅[12]的腸道均有分離出該細菌。即食食品[13-14]中的克羅諾桿菌的分離率較高，可見多種食品均存在克羅諾桿菌的污染。有研究發現，新生兒患腦膜炎主要與阪崎克羅諾桿菌克隆復合物CC4有關，而成人感染相關菌株集中在ST7和ST1型，ST12與新生兒壞死性小腸結腸炎有關。因此對克羅諾桿菌分離株進行準確的分型鑒定尤為重要，有利于對疾病爆發進行準確的預防[15-18]。

多位點序列分型（multilocus sequence typing，MLST）方法[19]已經成功地將臨床相關的克羅諾桿菌菌株聚集到特定的序列型別（sequence type，ST）或克隆復合體（clonal complex，CC）中，形成穩定的進化譜系。CC型包括3個或3個以上的ST型分型組，較為流行的ST型在細菌群組中占據最核心的位置[20]。克羅諾桿菌具有多種ST型，但許多新生兒腦膜炎病例主要是由阪崎克羅諾桿菌ST4型引起的[21]。2015年，ZENG H等[22]報道了一例由阪崎克羅諾桿菌株引起的新生兒腦膜炎病例，該菌株為新的多藥耐藥菌株，其序列型為阪崎克羅諾桿菌ST256。武漢市婦幼保健院[23]還從2例嬰兒腦膜炎患者體內分離出了多重耐藥性菌株，分別為丙二酸鹽克羅諾桿菌ST60和阪崎克羅諾桿菌ST83。2016年，南京市某兒童醫院[24]從重癥肺炎新生兒的痰標本中獲得了阪崎克羅諾桿菌ST1型菌株。2016年10年，南京江寧某中學[25]出現了疑似由克羅諾桿菌污染的千張燒肉引起的腹痛，腹瀉的食物中毒事件。

本文將對PubMLST數據庫中的中國克羅諾桿菌分離株（截至2019年6月28日，下載PubMLST數據庫（http：//pubmlst.org/cronobacter/）的克羅諾桿菌分離株提交信息，包括分離來源、分離時間和國家、血清型，克隆譜系和ST型等進行分析，利用Excel分析PubMLST數據庫中全球克羅諾桿菌的分離來源，分布情況，以及序列分型的多樣性，并著重分析中國的克羅諾桿菌的分布情況，對比中國臨床株與國外臨床株的致病情況，深入比較分離株的遺傳多樣性，揭示其進化關系，為檢測我國食品中的克羅諾桿菌提供理論依據。

1 PubMLST數據庫中克羅諾桿菌的全球分布狀況

截至2019年6月28日，從PubMLST數據庫（http：//pubmlst.org/cronobacter/）中下載的克羅諾桿菌分離株信息，篩選出具有完整ST型的分離株2 407株，包含657種ST型和52種CC型。

1.1 地區分布

如表1所示，在PubMLST總數據庫中，分離株主要來源是亞洲和歐洲：其中亞洲提交的分離株最多（992株），其中僅中國就提交907株，歐洲（899株）主要包括捷克、愛爾蘭、德國、英國和法國提交的菌株；其次為北美洲、大洋洲和南美洲：北美洲（274株）以美國提交的菌株為主；大洋洲（98株）以澳大利亞提交的菌株為主；南美洲（66株）以巴西提交的菌株為主；最少的是非洲（4株）。由此可見，以國家為單位，中國的克羅諾桿菌分離株數量最多，反映了我國學者充分利用PubMLST數據庫的積極性和能力，也為本文的分析提供了堅實的數據基礎。

表1 全球克羅諾桿菌分離株分布情況Table 1 Distribution of global Cronobacter isolates

1.2 分離來源

提交到數據庫中的克羅諾桿菌分離株主要來源于食品、臨床、環境等。如表2所示，我國提交的食品株最多，為580株，主要包括嬰幼兒配方奶粉（188株），香料（97株），食品配料（19株）以及即食食物（88株）；愛爾蘭提交的環境株最多，為88株；捷克提交的臨床株最多，為87株，而我國臨床株數量較少，僅有38株。

因克羅諾桿菌主要危害2歲以下嬰幼兒，而嬰幼兒配方奶粉（powdered infant formula，PIF）是其主要感染途徑，其中，PubMLST數據庫中PIF分離株的ST型分布如圖1所示，ST4和ST1是其中的主要型別，但我國分離株優勢型別中還有ST64，ST83，ST12型等；而其他國家的優勢型別則包括ST13，ST7，ST297，ST14型，與我國的數據存在一定的差異。ST4型菌株被認為與新生兒腦膜炎高度相關，卻是中外嬰幼兒配方奶粉中檢出率最高的克羅諾桿菌型，但該ST型在中國分離株中占比（19.1%）顯著低于國外（27.1%），另一個被認為與新生兒壞死性小腸結腸炎高度相關的致病型ST12（4.8%）卻在中國占有較高的比例，但在國外則無ST12，不占優勢。

表2 全球克羅諾桿菌分離株主要來源Table 2 Main sources of global Cronobacter isolates

圖1 嬰幼兒配方奶粉中完整序列型分布Fig.1 Distribution of complete sequence types in infant milk formula

2 克羅諾桿菌7個管家基因的保守性與多樣性

PubMLST數據庫中克羅諾桿菌分離株的等位基因統計結果顯示，7個管家基因片段的等位基因值在182～346之間，pps等位基因數目最多，為346個，其等位基因多樣性最為豐富；fusA等位基因數目最少，為182個，atpD等位基因數目也較少，為183個，可見這兩個管家基因在菌株間差異較小，與其他管家基因序列相比更為保守。

3 中國克羅諾桿菌分析

3.1 中國克羅諾桿菌分離株ST型和CC型分布狀況

篩選PubMLST數據庫，具有完整ST型的中國分離株有907株，占全球分離株的37.7%，但是我國的ST型和CC型分別為366種（占總數據的55.7%）和43種（占總數據的82.7%），可見中國的克羅諾桿菌分離株相對于其他國家地區分離株具有更為豐富的ST型和CC型。

圖2 中國分離株完整序列型與克隆復合體型分布Fig.2 Distribution of complete sequence types and clonal complex types of isolated strains in China

如圖2a所示，ST型主要包括ST4（89株），ST1（81株），ST64（44株），ST7（35株），ST8（27株），占總ST型的30.43%；其中ST4，ST1，ST64，ST8均屬于阪崎克羅諾桿菌（Cronobacterium sakazakii）；ST7屬于丙二酸鹽克羅諾桿菌（Cronobacter malonaticus）。

如圖2b所示，CC型主要包括CC4（103株，以ST4為核心），CC1（88株，以ST1為核心），CC7（54株，以ST7為核心），CC64（52株，以ST64為核心），CC8（32株，以ST8為核心），占總CC型的59.6%。

3.2 中國分離株來源和物種分布情況

表3 中國分離株主要來源和物種分布情況Table 3 Distribution of main sources and species of isolated strains in China

如表3所示，中國分離株主要來源于食品，包括嬰幼兒配方奶粉、香料、食品配料、即食食品以及蔬菜等。嬰幼兒配方奶粉中的分離株最多（188株），臨床分離株則較少（38株）；克羅諾桿菌屬7個種均存在于中國分離株中，其中阪崎克羅諾桿菌602株，丙二酸鹽陽性克羅諾桿菌143株以及都柏林克羅諾桿菌104株的數量最多。而前兩者在我國臨床分離株中占比卻高達92.1%。

水和環境分離株分別有38和31株，占比僅為8.9%，這與在我國克羅諾桿菌主要與食品安全特別是嬰幼兒食品安全高度相關，對其生態分布的研究不多有關。但也說明食品原料生產及加工環境中該菌的遍在性，污染途徑多樣，杜絕其污染的難度不小。

3.3 阪崎克羅諾桿菌ST4，ST12及丙二酸鹽克羅諾桿菌ST7型的分布以及來源分析

英國學者發現新生兒腦膜炎病例主要與阪崎克羅諾桿菌ST4型相關，中國ST4型分離株有89株，分布廣泛，如表4所示，主要來源為嬰幼兒配方奶粉、即食食品、奶粉、香料，同時在嬰兒面條、冰淇淋、乳清蛋白粉、蔬菜等中也有分離出，但臨床分離株非常少（2株）。

阪崎克羅諾桿菌ST12型與新生兒壞死性小腸結腸炎有關，中國ST12型分離株有14株，主要來源于嬰幼兒配方奶粉、嬰幼兒配方米粉、奶粉、即食食品以及香料中，未見臨床分離株。

表4 中國克羅諾桿菌ST4、ST12型與ST7型來源Table 4 Sources of Cronobacter ST4,ST12 and ST7 in China

丙二酸鹽克羅諾桿菌中ST7型被認為與成年人感染相關，中國ST7型分離株共有35株，主要來源于冰淇淋、即食食品、嬰幼兒配方米粉、水，從奶粉、香料、蔬菜、牛奶中也有分離出，但未見臨床分離株。

3.4 國內外中國臨床分離株比較

對PubMLST數據庫國外臨床株ST型分布進行統計結果表明，國外臨床株有365株，明確致病的菌株有53株，提交國家包括法國（29株），美國（17株），以色列（3株），新西蘭（2株），英國（1株），巴西（1株）。明確致病的ST4菌株有39株，占所有明確致病臨床株的73.6%，特別在嚴重致死感染中占比極為突出，如在導致壞死性小腸結腸炎菌株中占到83.3%，在腦膜炎、腦膿腫等腦部疾病致病株中占比70.0%，在其他如菌血癥、腹瀉等嚴重感染中占比55.5%。所以有學者明確指出ST4型與新生兒腦膜炎之間具有顯著相關性[21]。

PubMLST數據庫國外ST21分離株主要分離于成年人糞便，肺標本以及腹膜液；ST148（1株）分離自老年人血液中；ST60主要為成年人臨床株，但無進一步的臨床信息；ST256曾從絲光綠蠅消化道中分離出，但未出現臨床株；ST201無臨床株，僅有一株從食品配料中分離出。國外與嬰幼兒腦病相關的CC4型菌株（16株），包括ST4，ST107，ST109；其他ST型如ST1，ST307，ST494也會導致腦病；1998年以色列新生兒感染阪崎克羅諾桿菌病例中，從患敗血癥腦膜炎并發癥新生兒血液中分離出ST83菌株[26-27]；ST12會導致壞死性小腸結腸炎；ST8則與腹瀉有關；在法國嬰兒重癥監護室爆發克羅諾桿菌感染案例中，分離出3株ST13，兩株分離自無癥狀新生兒，一株分離自具有消化問題的新生兒[28]。值得引起注意的是都柏林克羅諾桿菌ST80和ST88曾引起病人膿腫；蘇黎世克羅諾桿菌ST19也曾引起新生兒致死性腦膜炎[29]；尤尼沃斯克羅諾桿菌ST59與腿部感染有關[30]。國外[31]曾報道兩例由克羅諾桿菌引起的血性腹瀉案例與我國報道的腹瀉事件癥狀略有不同。

我國臨床分離株（38株）主要為阪崎克羅諾桿菌（22株）和丙二酸鹽克羅諾桿菌（13株），同時出現了都柏林克羅諾桿菌（2株），蘇黎世克羅諾桿菌（1株）。與國外上傳的數據相比，我國明確致病菌株為阪崎克羅諾桿菌（13株）與丙二酸鹽克羅諾桿菌（5株），與腦膜炎有關的臨床株有ST256（1株），ST60（2株），ST83（2株），沒有ST4型；與肺炎相關的臨床株為ST1（3株）；未注明病癥的患者分離株有10株，包括ST1（1株），ST4（2株），ST13（2株），ST201（3株），ST21（1株），ST148（1株）。ST4菌株只有2株而且未注明致病情況，僅占臨床分離株的5.3%，我國也沒有任何臨床分離株為ST7型，與國外情況存在極大差異。

4 結束語

MLST數據庫中目前具有2407株完整ST型克羅諾桿菌菌株，分離源主要是亞洲和歐洲的國家，非洲，大洋洲等地區的克羅諾桿菌分離株較少，這可能是不同地區的檢測手段和重視程度不同。目前我國的克羅諾桿菌食品分離株較多，分布較為廣泛，除嬰幼兒食品、即食食品、香料、蔬菜外，冰淇淋、糖果等也有分離株。阪崎克羅諾桿菌ST1和ST4的食品分離株占比較大，且分離自嬰幼兒配方奶粉的ST4型（36株）和ST1型（26株）較多，與新生兒壞死性小腸結腸炎相關的ST12菌株也占較高的比例，雖然我國關于嬰幼兒配方奶粉中克羅諾桿菌檢測的工作開展范圍較廣，但LIU H等[7，32]從飲用水中也檢測到了克羅諾桿菌，可見克羅諾桿菌的污染可能會通過嬰幼兒配方奶粉以外的途徑傳播，并且我國香料中克羅諾桿菌檢出率也相當高，而且為避免揮發常在加熱殺菌后才加入，使其成為克羅諾桿菌的污染載體。HU J等[33]從環境和土壤中檢測出克羅諾桿菌，環境也可能是感染克羅諾桿菌的因素，應當引起重視。

從物種分布來看，我國分離株主要包括阪崎克羅諾桿菌（602株），丙二酸鹽克羅諾桿菌（143株）和都柏林克羅諾桿菌（104株）。我國臨床株中除阪崎克羅諾桿菌和丙二酸鹽克羅諾桿菌，也出現了都柏林克羅諾桿菌和蘇黎世克羅諾桿菌，國外曾出現過蘇黎世克羅諾桿菌引發新生兒致死性腦膜炎，因而克羅諾桿菌屬其他種的致病性也應當引起足夠的重視。另外，克羅諾桿菌以非典型食物中毒感染聞名，YONG W等[36]發現阪崎克羅諾桿菌不僅會影響嬰幼兒和免疫力低下成人，還可能作為食源性急性腸胃炎的病原體影響健康的成年人。

我國分離株中ST4，ST12和ST7型菌株較多，但主要是食品分離株，臨床株較少（ST1為4株，ST4為2株），ST7無臨床分離株。而數據庫中除了以色列之外其他亞洲國家均未見臨床株，我國臨床株也較少（38株），而我國菌株總數量在數據庫中占比高達37.7%，致病型菌株卻僅占9.4%。且我國有明確致病信息和型別的信息與歐美國家的致病型差異也很大：僅有ST256，ST60以及ST83與新生兒腦膜炎相關；中國的文獻中僅有1例克羅諾桿菌ST83致死的案例報道。PubMLST數據庫中提交的907株克羅諾桿菌中國分離株信息也證實我國學者的科研能力和對克羅諾桿菌的重視程度，因此可能是我國的克羅諾桿菌與其他國家地域的菌株在系統進化和毒力上具有差異，或者與該細菌的感染對象-人種差異有關。