響應(yīng)面法優(yōu)化風味驢乳酸奶發(fā)酵工藝的研究

楊 行，張 明，阿依帕夏·熱合曼，郭麗君，王 莉，王玉濤

（1.喀什大學 生命與地理科學學院葉爾羌綠洲生態(tài)與生物資源研究高校重點實驗室，新疆 喀什 844000；2.新疆玉昆侖天然食品工程有限公司，新疆 喀什 844000）

驢乳作為一種天然的食品資源，是低脂肪、低膽固醇的食品[1-2]，具有降低血脂血壓、軟化血管、抑制結(jié)核桿菌的作用[3-4]，具有抗菌抑菌[5]、抗癌抑癌[6]、消炎止痛[4]、抗疲勞、抗氧化等功效[7]，而驢乳蛋白屬于優(yōu)質(zhì)蛋白，包含多種生物活性成分，促進消化和吸收，增強人體免疫力，因此驢乳不僅具有較高的營養(yǎng)價值，更具有廣泛的藥用價值，因其獨特的成分，自古以來就被作為滋補營養(yǎng)品，也是治療和預(yù)防多種疾病的食療佳品[8-9]。酸奶是指乳在發(fā)酵劑（特定菌）的作用下發(fā)酵而成的乳制品，酸奶營養(yǎng)豐富、風味獨特、易于消化吸收，是一種能提高人體免疫力、降低膽固醇、預(yù)防心腦血管疾病、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、有效緩解乳糖不耐癥的健康食品，近年來驢乳酸奶成為研究和開發(fā)利用的熱點，受到乳品、食品界的普遍關(guān)注[10-11]。

關(guān)于驢乳酸奶的開發(fā)研究，CHIAVARI C等[12]使用鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）和干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）發(fā)酵驢乳，制成發(fā)酵驢乳飲料；彭珊珊等[13]研究發(fā)現(xiàn)，鼠李糖乳桿菌（L.rhamnosus）、羅伊乳桿菌（Lactobacillus reuteri）等6株乳酸菌均可使驢乳凝乳，其中羅伊乳桿菌（L.reuteri）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）凝乳最快；PERNA A等[14]使用嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）、干酪乳桿菌（L.casei）發(fā)酵驢乳，生產(chǎn)出一種功能型的發(fā)酵飲料；TURCHI B等[15]以植物乳桿菌（L.plantarum）和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）為發(fā)酵劑制作驢乳發(fā)酵飲料；MARIA M等[16]研究發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌（L.casei）、鼠李糖乳桿菌（L.rhamnosus）都能成功發(fā)酵驢乳。這些都有助于開發(fā)一種具有抗高血壓、抗菌、抗氧化性的功能型發(fā)酵驢乳制品。由于驢乳乳清蛋白含量高、酪蛋白含量低，相對牛羊乳發(fā)酵不容易凝乳，所以大部分研究都以乳酸菌發(fā)酵驢乳制成功能性發(fā)酵飲料。本研究在發(fā)酵驢乳時加入一定比例的全脂中乳粉，制成凝固型的風味驢乳酸奶，采用單因素試驗響應(yīng)面法對風味驢乳酸奶的生產(chǎn)工藝進行優(yōu)化，得出風味驢乳酸奶的最佳生產(chǎn)工藝，為風味驢乳酸奶的生產(chǎn)制作提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

全脂牛乳粉：新疆南達乳業(yè)有限公司；鮮驢乳（含水量90.59%，全乳固體9.41%，其中蛋白質(zhì)1.60%、脂肪1.04%、乳糖6.34%、灰分0.39%[2]）、蔗糖：市售；乳酸菌：北京多愛特生物科技有限公司；MRS培養(yǎng)基、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂：北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；無水乙醇、氫氧化鈉、氯化鈉、酚酞（均為分析純）天津致遠化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YP6002電子天平：余姚市金諾天平儀器有限公司；LD2X-50KBSS立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；DHP-500型電熱恒溫培養(yǎng)箱：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；BCD-205HK電冰箱：海信科龍電器股份有限公司；PHS-3C pH計：上海雷磁儀器廠；SW-CS-2F凈化工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；NDJ-5S黏度計：浙江力辰儀器科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 風味驢乳酸奶加工工藝流程[17]

鮮驢乳＋全脂中乳粉＋水→預(yù)熱→添加蔗糖→高溫殺菌→冷卻→添加發(fā)酵劑→混勻后裝瓶→發(fā)酵→冷卻至室溫→后熟→檢驗→成品

操作要點：用45 ℃左右的溫水將一定量的全脂牛乳粉、鮮驢乳溶解混勻，預(yù)熱后添加一定比例的蔗糖，攪拌溶解；95 ℃水浴加熱5 min進行滅菌，迅速冷卻至45 ℃，接種發(fā)酵劑是保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）為1∶1的凍干乳酸菌粉，接種量為0.04 g/kg，無需活化可直接投放；接種完畢混合均勻，灌裝至經(jīng)過滅菌（121 ℃、20 min）的玻璃瓶中于42 ℃條件下靜置發(fā)酵5～6 h；凝乳狀態(tài)均勻、滴定酸度達到80～90°T后，發(fā)酵結(jié)束；將酸奶放入4℃冰箱冷藏24 h后熟，得到風味驢乳酸奶。

1.3.2 發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

固定發(fā)酵溫度42 ℃、發(fā)酵時間6 h的條件下考察牛乳粉添加量分別為8%、9%、10%、11%、12%對酸奶品質(zhì)的影響；固定牛乳粉添加10%、發(fā)酵時間6 h的條件下考察發(fā)酵溫度分別為40 ℃、41 ℃、42 ℃、43 ℃、44 ℃對酸奶品質(zhì)的影響；固定牛乳粉添加10%、發(fā)酵溫度42 ℃的條件下考察發(fā)酵時間分別為5.0 h、5.5 h、6.0 h、6.5 h、7.0 h對酸奶品質(zhì)的影響。

1.3.3 發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇牛乳粉添加量（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時間（C）為自變量，以感官評價（Y）為因變量，利用Design-Expert 8.0.6軟件，進行Box-Behnken試驗設(shè)計[18]，響應(yīng)面試驗設(shè)計因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken tests design

1.3.4 風味驢乳酸奶各項指標測定

（1）感官評價

由食品專業(yè)的學生及食品企業(yè)工作人員，采用百分制評分方法，對每一次發(fā)酵成熟的風味驢乳酸奶在室溫條件下放置15 min再進行品嘗評分，避免較涼的溫度影響口感。感官評分標準見表2。

第一，完善安裝工藝結(jié)構(gòu)，施工部門要從精細化施工結(jié)構(gòu)出發(fā)，確保具體質(zhì)量操作管理工序的完整性，有效分析整體質(zhì)量要求的基礎(chǔ)上，就要盡量對溫度進行控制管理，以保證能減少漏焊和跳焊問題等，按照功能要求對結(jié)構(gòu)獨特性予以認知，從而完善設(shè)計效率，也為工程項目安全性提供保障[6]。

（2）理化指標

pH的測定采用pH計直接測定；總酸度的測定：參照國標GB 5413.34—2010《乳和乳制品酸度的測定》中的滴定酸度法進行測定[19]，采用滴定酸度法，用吉爾涅爾度（°T）表示；持水力的測定：參考相關(guān)文獻[20]，取酸奶10 g，室溫條件下5 000 r/min離心30 min，棄上清液，離心管倒置10 min后立即稱質(zhì)量，計算持水力（持水力=離心沉淀物質(zhì)量/樣品質(zhì)量×100%）。

黏度測定：使用黏度計，選用3號轉(zhuǎn)子和12 r/min的轉(zhuǎn)速，計時1 min后讀取數(shù)值[20]。測定三組平行，取平均值。

（3）微生物指標

乳酸菌數(shù)測定：參照國標GB 4789.35—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》進行測定[21]，將酸奶稀釋成10-5、10-6、10-7的稀釋液，取1 mL稀釋液均勻涂布于MRS平板培養(yǎng)基上，每個稀釋度做2個重復，（36±1）℃培養(yǎng)48 h后計數(shù)平板上所有菌落數(shù)。大腸桿菌測定：參照GB 4789.3—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸菌群計數(shù)》進行測定[22]，將酸奶稀釋成10-1、10-2的稀釋液，取1 mL稀釋液均勻涂布于結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基上，每個稀釋度做2個重復，（36±1）℃培養(yǎng)24 h后計數(shù)平板上所有菌落數(shù)。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)以“平均值±標準差”表示，使用Excel 2007進行統(tǒng)計整理，用SPSS Statistics 23.0軟件進行方差分析，用Origin、GraphPad軟件進行制圖，用Design-Expert 8.0.6進行響應(yīng)面及數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 風味驢乳酸奶發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗結(jié)果與分析

由表3可知，牛乳粉添加量對風味驢乳酸奶品質(zhì)影響較大，隨著牛乳粉添加量逐漸增大，酸奶pH值逐漸下降，其他的各項理化指標均呈現(xiàn)上升狀態(tài)。當牛乳粉添加量為8%～10%時，酸奶組織不均勻，狀態(tài)較為稀松；當牛乳粉添加量為10%時，酸奶組織均勻，流動性好，牛乳味、驢乳味香氣平衡，感官評分最高，為88.75分；當牛乳粉添加量＞10%時，酸奶黏度上升，口感上也太黏稠，已品嘗不出驢乳的香甜味，感官評分下降顯著。因此，選擇牛乳粉添加量為10%。

表3 牛乳粉添加量對風味驢乳酸奶品質(zhì)的影響Table 3 Effect of cow milk powder addition on the quality of yoghurt with donkey milk flavor

2.1.2 發(fā)酵溫度對風味驢乳酸奶品質(zhì)的影響

由表4可知，較低溫度發(fā)酵酸奶感官品質(zhì)較差，組織松散，酸度較低，凝乳狀態(tài)不佳，酸奶的香氣奶味不足；隨著發(fā)酵溫度的上升，酸奶的品質(zhì)與感官評分都有所上升，在發(fā)酵溫42 ℃左右時達到感官評分峰值，為88.50分，此時酸奶組織結(jié)構(gòu)均勻，酸甜適中，有濃郁的驢乳香甜味；之后隨發(fā)酵溫度繼續(xù)上升，感官評分有所下降，酸奶酸度、黏度有所上升，并有乳清析出，影響了口感。因此，選擇發(fā)酵溫度為42 ℃。

表4 發(fā)酵溫度對風味驢乳酸奶品質(zhì)的影響Table 4 Effect of fermentation temperature on the quality of yoghurt with donkey milk flavor

2.1.3 發(fā)酵時間對風味驢乳酸奶品質(zhì)的影響

由表5可知，隨著發(fā)酵時間的延長，風味驢乳酸奶的感官評分呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。發(fā)酵時間為5.0 h時，酸奶凝固狀態(tài)松散，口感稀薄，香味不明顯；發(fā)酵至5.5時，酸奶的凝固性大幅度提升，酸度也有所增加，酸奶中的香氣明顯，感官評分在5.5 h達到最高，為89.0分；當發(fā)酵時間＞6.0 h以后，酸奶酸味上升，并有乳清析出的現(xiàn)象，口感略顯粗糙，感官評分隨之下降。因此，選擇發(fā)酵時間為5.5 h。

表5 發(fā)酵時間對風味驢乳酸奶品質(zhì)的影響Table 5 Effect of fermentation time on the quality of yoghurt with donkey milk flavor

2.2 風味驢乳酸奶發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇牛乳粉添加量（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時間（C）為自變量，以感官評價（Y）為因變量，利用Design-Expert 8.0.6軟件，進行Box-Behnken試驗設(shè)計[18]，響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計方案及結(jié)果見表6，方差分析結(jié)果見表7。

利用Design-Expert 8.0.6軟件對表6數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，得到模型的二次多項回歸方程：Y=90.80-0.75A+0.88B+0.38C+0.50AB-1.0AC-1.75BC-6.53A2-6.77B2-5.77C2。

由表7可知，試驗選用的模型P＜0.000 1，極顯著，失擬項P=0.177 6＞0.1，不顯著，表明模型在本實驗中的擬合度良好；回歸決定系數(shù)R2=0.986 0、校正決定系數(shù)R2Adj=0.968 0，說明模型擬合度良好，試驗誤差小，該模型能解釋96.8%響應(yīng)值的變化；變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）為1.35%＜5%，表明方程有良好的重現(xiàn)性。信噪比為18.345，遠大于4，說明模型可信度較高，可以用于風味驢乳酸奶發(fā)酵工藝參數(shù)的優(yōu)化。二次項A2、B2、C2對結(jié)果影響極顯著（P＜0.05）。

表6 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 6 Design and results of Box-Behnken tests

表7 回歸模型方差分析Table 7 Variance analysis of regression model

響應(yīng)面分析圖是由響應(yīng)值和各試驗因子構(gòu)成的立體曲面圖，顯示了A、B、C中任意一個變量取零水平時，其余兩個變量對感官評分的影響。響應(yīng)面圖坡度越大，該因素對感官的影響也越大，但兩個因素存在交互作用時，一個因素在另一個因素的不同水平對感官的影響過程有差異[23]。由圖1可知，本次研究響應(yīng)面圖均呈現(xiàn)開口向下的鐘罩形，即隨著因素水平的增加，感官呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢。等高線圖是曲面上相同的響應(yīng)值在底面上形成的曲線，等高線越趨近于正圓，說明兩者的交互作用越小，AB、AC、BC等高線越趨近于橢圓，說明兩者的交互作用越大，等高線的密集程度反映了該因素對感官的影響程度，等高線越密集，對感官品質(zhì)影響越大。

圖1 乳粉添加量、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時間交互作用對風味驢乳酸奶感官品質(zhì)影響的響應(yīng)面及等高線Fig.1 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between cow milk powder addition,fermentation temperature and time on sensory evaluation quality of yogurt with donkey milk flavor

2.3 最佳工藝條件的預(yù)測和驗證試驗

利用Design-Expert 8.0.6對風味驢乳酸奶的發(fā)酵工藝參數(shù)進行預(yù)測，當牛乳粉添加量為9.94%、發(fā)酵溫度為42.06 ℃、發(fā)酵時間為5.51 h時，感官評分預(yù)測值為90.85分。為了方便實際操作，將發(fā)酵工藝修正為牛乳粉添加量10%、發(fā)酵溫度42.0 ℃、發(fā)酵時間5.5 h，在此條件下進行3次平行驗證試驗，風味驢乳酸奶呈乳白色、組織均勻、無分層、無乳清析出，口感酸甜適中、順滑細膩；風味協(xié)調(diào)、有驢乳特有的香氣和乳香味，感官評分實際值為92分，與預(yù)測值90.85分極為接近，說明響應(yīng)面優(yōu)化的結(jié)果是可靠的，具有實際應(yīng)用價值。

3 結(jié)論

本試驗通過單因素試驗和響應(yīng)面優(yōu)化法優(yōu)化風味驢乳酸奶發(fā)酵工藝。結(jié)果表明，以牛乳粉添加量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間為自變量，響應(yīng)面法優(yōu)化得出風味驢乳酸奶的最佳發(fā)酵工藝為牛乳粉添加量10%，發(fā)酵溫度42 ℃，發(fā)酵時間5.5 h。在此優(yōu)化條件下，生產(chǎn)出的風味驢乳酸奶口感細膩爽滑，酸甜適口，有濃郁的驢乳香味與滋味，無異味。實測感官評分達到92分，與預(yù)測值90.85分基本相符。此結(jié)果可充分驗證該試驗?zāi)Ｐ偷目煽啃浴ｏL味驢乳酸奶酸度為86 °T，乳酸菌數(shù)為9.7×107CFU/mL，其品質(zhì)完全符合國家發(fā)酵乳的標準[24]。