響應面法優化紅心火龍果皮發酵飲料發酵工藝

廖明星，吳華鑫，繆園欣

（1.荊楚理工學院 生物工程學院，湖北 荊門 448000；2.湖北省荊門市動物衛生監督所，湖北 荊門 448000）

火龍果（Hylocereus undulatusBritt）又稱紅龍果，一般為深紅色表皮，白色或紅色果肉。火龍果富含多種有益健康的營養成分，如磷、鉀、鎂等多種礦質元素和維生素[1-2]，其果肉中的碳水化合物大多是天然葡萄糖，容易吸收，還含有豐富的植物白蛋白和氨基酸[3]。火龍果含有豐富的花青素類物質，以紅心火龍果為最。花青素在自然界中分布極為廣泛，為許多植物性食物提供鮮艷的顏色[4]。花青素被認為是類黃酮的一種，具有保護心血管彈性[5]、預防肥胖[6-7]、改善人體視力[8]和預防癌癥[9-11]等藥理作用及生物活性[12]。近年來，大量文獻資料也陸續報道了花青素和花色苷在治療癌癥和細菌感染等方面的作用[13]。

火龍果果皮占其果總質量的1/3左右，通常作為廢棄物丟棄。但火龍果皮中有很高含量的花青素類物質，可用于提取功能性成分作為保健產品、食品添加劑的配方。有許多研究證實可以通過簡單、經濟的方式獲取火龍果皮中的功能性成分[14-15]，超聲輔助提取火龍果皮花色苷為159.15 mg/100 g[16]，花青素為98.45 mg/100 mg[17]。火龍果皮因其具有高附加值，也被用于作為發酵原料、制作果皮粉等[18]。

將火龍果皮發酵為富含天然營養物質和生物活性物質[19]的發酵飲料，既可以利用果皮開發新型的保健產品，又可以使火龍果皮中的花青素得到充分的利用。花青素類物質在生產加工過程中，由于各種因素的影響并不穩定，容易降解。目前，有關于花青素保存和發酵飲料制備的研究較多，但以火龍果皮為原料釀造發酵飲料的研究還很少。本試驗以紅心火龍果果皮為原料釀造發酵飲料，先通過單因素試驗，得到料水比，酶添加量，初始糖度和酵母菌接種量4個影響因素的最優水平，再用響應曲面試驗分析多因素間的交互作用，確定最優的發酵工藝條件，為花青素在釀造過程中的保藏奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅心火龍果、白砂糖（食品級）：市售；纖維素酶（50000U/g）、果膠酶（40 000 U/g）：南寧東恒華道生物科技有限責任公司；Angel安琪高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；乳酸菌：北京陸橋技術股份有限公司；兒茶素標準品（純度≥98%）：酷爾化學科技有限公司；香草醛（純度≥98%）：國藥集團化學試劑有限公司；無水甲醇、無水乙醇、濃鹽酸（均為分析純）：天津市福晨化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

JY1002電子天平：上海蒲春計量儀器有限公司；TU-1901紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；HHS-4S電子恒溫不銹鋼水浴鍋：上海光地儀器設備有限公司；BCD-215KS電冰箱：青島海爾股份有限公司；ZHWY-200B恒溫振蕩培養箱：上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程及操作要點

操作要點

預處理：挑選新鮮，無霉變，無病蟲害的紅心火龍果，用清水洗凈后晾干紅心火龍果表面的水分，撕下果皮，將果皮切碎備用。

破碎：按料水比稱取紅心火龍果皮和蒸餾水，一同加入果汁機中破碎，得到果漿。

酶解：取150 mL果漿置于250 mL發酵瓶中，調節pH至5左右，向其中加入0.4%纖維素酶和果膠酶復合酶解，置于50 ℃水浴中酶解2.5 h，酶解結束后90 ℃滅酶30 s。纖維素酶添加量為0.4%[20]。

過濾：將酶解后的果漿使用80目濾布過濾除去果渣，收集果汁備用。

成分調整：向果汁中加入白砂糖糖粉，調節果汁的糖度。

滅菌：采用巴氏殺菌的方式對火龍果皮汁進行殺菌，85 ℃殺菌15 min后冷卻至室溫。

菌種活化：取一定量的酵母菌和乳酸菌，分別用10倍蒸餾水溶解，35 ℃恒溫水浴鍋中活化40 min備用[21]。

接種：向果汁中接種酵母菌和乳酸菌混合發酵，乳酸菌接種量為0.1%[21]。

發酵：將接種后的果汁置于恒溫培養箱中靜置培養，35 ℃培養6 d得到發酵飲料[22]。

1.3.2 花青素含量的測定

參考朱曼利等[23]的研究，用兒茶素標準曲線代替原花青素繪制標準曲線，測定發酵液花青素含量。分別吸取1.0 mg/mL兒茶素標準溶液0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL于刻度試管中，用無水甲醇定容至1 mL，加入5 mL 5 g/100 mL的香草醛甲醇溶液，4 mL 10%鹽酸甲醇溶液，混勻后，35 ℃條件下顯色反應20 min，在波長500 nm處測定吸光度值，以兒茶素標準溶液質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，繪制標準曲線[24]得到標準曲線回歸方程y=0.155 8x+0.298 0，相關系數R2為0.990 5。

1.3.3 花色苷含量的測定

取1 mL火龍果酒發酵液于試管中，加入9 mL鹽酸-乙醇溶液，置于暗處反應15 min，然后用鹽酸-乙醇溶液作空白對照，在波長535 nm處測吸光度值。

式中：A535nm為波長535 nm處的吸光度值；98.2為花色苷在535 nm處的平均消光系數；10為稀釋倍數。

1.3.4 總酸度的測定

發酵飲料中的酸類物質為多種弱酸的混合物，可以使用酸堿滴定法用強堿滴定測定總酸度，參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》。

1.3.5 火龍果皮發酵飲料發酵工藝優化試驗

調整料水比分別為1∶15、2∶15、1∶5、4∶15、1∶3（g∶mL）；果膠酶添加量分別為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%；初始糖度分別為14%、16%、18%、20%、22%；酵母菌接種量分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%。采用單一變量控制法進行單因素試驗，所有分組樣品發酵完成后對各組中花青素、花色苷含量及總酸度進行測定。

1.3.6 響應曲面優化試驗

根據Box-Behnken試驗設計原理，選擇4個單因素中對花青素、花色苷含量及酸度影響較大的3個因素：果膠酶添加量（A）、初始糖度（B）和酵母菌接種量（C）為變量，在料水比為1∶5（g∶mL）的水平下建立響應曲面回歸模型，以花青素含量（Y1）、花色苷含量（Y2）、酸度（Y3）為響應值，按照3因素3水平進行響應曲面法試驗。響應曲面試驗設計因素水平編碼表見表1。

表1 紅心火龍果皮發酵飲料發酵工藝優化響應曲面試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for optimization of fermentation technology of fermented red dragon fruit peel beverage

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 料水比對花青素、花色苷含量及酸度的影響

以料水比為變量釀造發酵飲料，分別測定發酵飲料中花青素、花色苷的含量和總酸度。結果見圖1。

圖1 料水比對花青素、花色苷含量及酸度的影響Fig.1 Effect of liquid-solid ratio on anthocyanin,anthocyanins contents and acidity

由圖1可知，在試驗范圍內，隨著料水比的增加，花青素含量和花色苷含量都呈現增大的趨勢，并在料水比為1∶5（g∶mL）時，二者都有最大的保留率。但是，當料水比繼續增大時，花青素、花色苷含量反而逐漸降低。可能是在料水比較低時，初始發酵液中含有的花青素、花色苷總量較少，在發酵結束后發酵液中所保留的色素濃度也比較低。隨著料水比的增大，初始發酵液中含有的花青素、花色苷總量也隨著增大，從而有較高的保留率。在料水比超過1∶5（g∶mL）之后，雖然此時初始發酵液中的色素含量較高，但過高的料水比使得發酵不充分，導致此時發酵液的酸度降低，而花色素苷會隨著酸性的降低降解為查耳酮，導致其含量的下降。酸度的變化情況也與色素相似，在料水比逐漸增大至1∶5（g∶mL）時有最大值，這可能是隨著料水比的增加，可溶物固形物含量和其他的營養物質也隨之增加，利于酵母菌和乳酸菌生長；但當料水比過高時，發酵液的濃度過高，水分活度的降低和溶解氧的減少影響了酵母菌和乳酸菌的生長。因此，料水比選擇為1∶5（g∶mL）比較合適。

2.1.2 果膠酶添加量對花青素、花色苷含量及酸度的影響

以果膠酶添加量為變量釀造發酵飲料，分別測定發酵飲料中花色素、花色苷的含量和總酸度。結果見圖2。

由圖2可知，在試驗范圍內，隨著果膠酶添加量的逐漸增大，發酵飲料中的花青素、花色苷含量也逐漸增大。這是因為在果膠酶添加量較低時，加入的所有果膠酶都能夠與底物結合并發生反應，此時發生的是酶催化反應的一級反應，所以隨著果膠酶添加量的增加，花青素和花色苷的釋放量也增加。但當果膠酶添加量達到0.8%時，花青素和花色苷含量達到最大值，這是由于與酶結合發生反應的底物的量是一定的，此時底物已經被充分反應，再繼續增大果膠酶添加量，不能夠增大花青素、花色苷的釋放量。酸度也在果膠酶添加量0.8%時出現最大值，這是由于此時的酶濃度已經達到最適，能夠使可溶固形物和其他營養物質被充分釋放，最利于酵母菌和乳酸菌生長。因此，選擇0.8%的果膠酶添加量較為合適。

圖2 果膠酶添加量對花青素、花色苷含量及酸度的影響Fig.2 Effect of pectinase addition on anthocyanin,anthocyanins contents and acidity

2.1.3 初始糖度對花青素、花色苷含量及酸度的影響

以初始糖度為變量釀造發酵飲料，分別測定發酵飲料中花色素、花色苷的含量和總酸度。結果見圖3。

圖3 糖度對花青素、花色苷含量及酸度的影響Fig.3 Effect of sugar content on anthocyanin,anthocyanins contents and acidity

由圖3可知，在試驗范圍內，隨著初始糖度的逐漸增大，發酵飲料的花青素、花色苷含量逐漸增大，但在初始糖度過高時，花青素和花色苷在發酵液中的含量又有所減小。這是由于在初始發酵液中的糖類物質含量較低時，溶解氧較多，水分活度也較大，加快了花青素類物質的分解。在初始發酵液中的糖類物質含量較高時，由于水分活度的降低和溶解氧濃度的下降，使得花青素和花色苷的分解速度降低，所以高濃度糖能夠使花青素和花色苷保持穩定。同時，適宜的糖度也有利于酵母菌生長，可以加快酒精的產生，有利于色素的溶解。但在初始糖度為22%時，此時高濃度的糖分子能與色素分子爭奪水分子，影響了花青素和花色苷的溶解釋放，而且此時糖度過高，抑制了酵母的生長和發酵，使得酒精的產生變慢，不利于色素的溶出。發酵液的初始糖度也影響酵母和乳酸菌的生長，從而影響有機酸的產生。因此，選擇初始糖度為20%，更有利于色素的保留和發酵飲料制備。

2.1.4 酵母菌接種量對花青素、花色苷含量及酸度的影響

以酵母菌接種量為變量，分別測定發酵飲料中花色素、花色苷的含量和總酸度。結果見圖4。

圖4 酵母菌接種量對花青素、花色苷含量及酸度的影響Fig.4 Effect of yeast inoculum on anthocyanin,anthocyanins contents and acidity

由圖4可知，在驗證范圍內，花青素和花色苷含量隨著酵母菌接種量的增大而呈現出先增大，后減小的趨勢。這是因為，當酵母接種量很低時，乙醇和有機酸的產率也比較低，不利于花青素和花色苷的保存。隨著接種量的增大，發酵液中的乙醇含量和酸度也在增大，降低了花色素苷的降解速率。但酵母接種量過高時，發酵液中的酵母濃度會高很多，在發酵初期酵母的迅速增殖，會導致糖類在短時間內迅速被消耗，增大發酵液的水分活度，并且大量的細胞代謝物也會加快花色素苷的降解，從而降低花青素和花色苷的含量。同時，過高濃度和過低濃度的初始菌群數量都不利于發酵飲料的釀造，因此，選擇酵母菌接種量為0.3%較為合適。

2.2 響應曲面試驗結果分析

根據Box-Behnken試驗設計原理，選擇對花青素、花色苷含量及酸度影響較大的3個因素，果膠酶添加量（A）、初始糖度（B）和酵母菌接種量（C）為變量，在料水比為1∶5（g∶mL）的水平下建立響應曲面回歸模型，總酸度（Y）為響應值。結果見表2，方差分析見表3。

以總酸度為響應值，進行多元二次回歸擬合分析，確定其方程為：酸度=0.44-0.032A-0.008 1B-0.003C-0.017AB-0.015AC+0.000 75BC-0.061A2-0.036B2-0.07C2。

表2 紅心火龍果皮發酵飲料發酵工藝優化響應面試驗設計與結果Table 2 Design and results of response surface tests for optimization of beverage fermentation technology of fermented red dragon fruit peel beverage

表3 二次回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of quadratic regression model

對表2中Y進行方差分析，結果見表3。該回歸模型P值=0.003 7＜0.05極其顯著，說明模型建立良好，失擬項P值=0.262 3＞0.05不顯著。說明該模型中，酸度與其他變量之間對應關系良好。復相關系數R2為0.923 5，修正復相關系數R2Adj為0.825 2，說明有82.52%的試驗符合該模型，由于試驗中的其他因素干擾，僅有17.48%的試驗不符合該模型，該模型可適用于大多數情況，與實際符合情況良好。因素A、A2、B2、C2均達到顯著水平（P＜0.05），說明響應值酸度與其他變量因素之間也有交互作用。根據F值，各因素對發酵飲料的酸度的影響次序為A＞B＞C。

2.3 驗證試驗

根據響應曲面試驗設計，以酸度為評價指標，得到最佳的發酵工藝為料水比1∶5（g∶mL），酶添加量0.78%，初始糖度20.02%，酵母菌接種量0.29%。在此工藝下，花青素含量的理論值為0.600 mg/mL，花色苷含量的理論值為1.894 mg/mL，總酸度的理論值為0.438 g/100 mL。

在其他條件不變的情況下，為方便實際操作，修訂最佳工藝條件為果膠酶添加量0.8%，初始糖度20%，酵母菌接種量0.3%。嚴格按照上述方法在該工藝條件下釀造發酵飲料，得到花青素含量為0.61 mg/mL，花色苷含量為1.90 mg/mL，總酸度為0.44 g/100 mL。花青素含量的相對誤差為0.8%，花色苷含量的相對誤差為0.2%，酸度的相對誤差為0.5%，三個響應值的相對誤差皆小于1%，且其結果均比響應曲面理想值略高，表明響應曲面設計可信性高，準確度好，符合實際情況。

2.4 火龍果發酵飲料的品質指標分析

2.4.1 感官指標

色澤：深紅色，色澤均勻有光澤；口味：口感柔和醇正，微酸不刺激；香氣：有火龍果清香味，伴有發酵香氣；組織狀態：液態，均勻無結塊。

2.4.2 理化指標

花青素含量為0.61 mg/mL，花色苷含量為1.90 mg/mL，總酸度為0.44 g/100 mL，酒精含量為0.13%vol。

2.4.3 微生物指標

細菌總數≤10CFU/mL，大腸桿菌菌群＜3MPN/100mL，未檢出致病菌。

3 結論

本試驗以紅心火龍果皮為原料，通過響應曲面法優化紅心火龍果皮發酵飲料的發酵工藝，確定飲料品質最佳的發酵工藝為料水比1∶5（g∶mL），酶添加量0.8%，初始糖度20%，酵母菌接種量0.3%，該工藝條件下制得的發酵制品花青素含量為0.61 mg/mL，花色苷含量為1.90 mg/mL，酸度為0.44 g/100 mL，發酵制品顏色呈鮮紅色，液體通透，口感自然醇厚，入口綿滑細膩。這為火龍果皮的進一步開發利用提供了理論依據。