發酵菌種對薏米乳品質及代謝產物的影響

尚 英，杜曉宏，熊榮園

（南充職業技術學院，四川 南充 637131）

薏米是我國傳統的滋養食品，其中不僅富含豐富的薏苡酸、薏仁素三萜類化合物、甾醇類化合物和生物堿等功能性成分[4-5]，還含有豐富的氨基酸、粗纖維以及眾多微量元素[6-7]。近年的研究表明，薏米具有抗氧化、延緩衰老等功能，薏仁酯也具有抗癌防癌的功效[8-12]。因薏米具有較高營養價值，所以薏米功能性食品也日益增多，其中很早就有研究將薏米粉與脫脂牛乳進行混合后發酵得到新型發酵薏米乳飲品[13]，并對其工藝進行優化[14]。所用的發酵菌種常為保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）的混合菌以及從酸菜等其他發酵食品中分離的乳酸菌[15]，但是關于不同菌種發酵對薏米乳產品的影響缺少詳細的研究。

代謝組學技術是檢測生物體整體代謝特征的技術，隨著技術的發展，近年來代謝組學技術已被大量地應用于食品的研究中[16-17]，代謝組學技術可以探索特定食物、食物成分或食物組合的代謝效應，也就是說，了解食物與生物體生物化學反應方面的相互作用。對于國內的研究主要關注某種條件的改變對食品中代謝物質的影響，從而探索某些代謝途徑的變化，相關結論為開發新型功能性食品提供理論依據[18-19]。本研究在對不同菌種發酵薏米乳營養品質及感官品質研究的基礎上，又利用非靶向代謝組學技術對不同菌種發酵薏米乳產品的差異代謝產物進行更深一步分析，為充分發揮發酵薏米乳產品的營養功能提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

薏米粉：普江市煥榮堂貿易有限公司；保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）：法國DANISCO公司；電子舌內部溶液、參比溶液、陰、陽離子溶液：日本Insent公司。

1.2 儀器與設備

FW100 高速萬能粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；YR-8 超微粉碎機：濟南銀潤包裝機械有限公司；手持式阿貝折光儀：上海西光實業有限公司；NDJ-1黏度儀：上海天平儀器廠；SOX 406 脂肪測定儀：蘇州貝銳儀器科技有限公司；RE52C旋轉蒸發儀：沈陽凱威爾實驗儀器有限公司；KDN-04C消化爐：浙江托普儀器有限公司；CT3質構儀：美國TA儀器公司；SA402B電子舌：日本Insent公司；SHP8200 LC/TOFMS液相色譜-飛行時間質譜聯用儀：ABSCIEX公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 發酵薏米乳的制備

薏米磨粉過篩→超微粉碎→加水攪拌→加糖→殺菌→接種發酵→成品

取適量薏米粉過60目篩，室溫下經超微粉碎機粉碎至粒徑約0.05 mm備用。取薏米粉20 g分別加入300 mL蒸餾水中，70 ℃水浴條件下攪拌5 min，取白糖40 g溶于200 mL蒸餾水中攪拌均勻，并與薏米粉溶液混合攪拌均勻。將混合好的薏米乳于90 ℃條件下殺菌5 min，降溫至40 ℃準備接種發酵。

準備上述薏米乳3份，分別加入0.005%的保加利亞乳桿菌、植物乳桿菌、瑞士乳桿菌，攪拌均勻后放入37 ℃培養箱中發酵10 h，得到發酵薏米乳樣品。樣品制備重復3次，并將3次制備的樣品進行混合后用于后續試驗測定。

1.3.2 不同菌種發酵薏米乳中營養成分含量的測定

可溶性固形物的含量通過手持式折光儀進行測定[20]；蛋白質含量測定按照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》中凱氏定氮法[21]；脂肪含量測定按照GB 5009.6—2016《食品安全國家標準食品中脂肪的測定》中索氏提取法[22]；三萜含量測定參照香草醛-硫酸比色法[23]；多糖含量采用硫酸-苯酚法[24]。

1.3.3 不同菌種發酵薏米乳電子舌味感的測定

取50 mL的發酵薏米乳樣品于6 000 r/min離心5 min。取上清液5 mL加入5倍體積的蒸餾水，于室溫條件下靜置2 h，待液體穩定后利用電子舌儀器測定其酸、苦、澀、咸、鮮五種味感的豐富度。試驗重復3次。

1.3.4 不同菌種發酵薏米乳樣品的物性及黏度的測定

通過TA質構分析儀分析不同菌種發酵薏米乳樣品的質構特性。采用直徑為2.5 cm的錐底圓柱形探針進行分析，測試前的速率為4.0 mm/s，測試速率1.0 mm/s 進入樣品20 mm的深度，測試樣品被壓縮兩次，間隔時間為4 s[25]。記錄待測樣品的硬度、粘力、膠著性、咀嚼性指數。不同菌種發酵薏米乳樣品的黏度通過NDJ-1黏度計進行測定。試驗重復三次。

1.3.5 不同菌種發酵薏米乳代謝組學分析

（1）樣品預處理

精確移取100 μL待測樣品；加入800 μL預冷提取溶液（甲醇∶乙腈=1∶1，V/V）于樣品中，高通量組織破碎儀破碎；渦旋混勻后，冰上超聲萃取10 min，重復3次；將樣品-20 ℃靜置30 min；12 000 r/min、4 ℃離心15 min，離心后取上清液，氮氣吹干100 μL復溶液（乙腈∶水=1∶1，V/V）復溶備用。試驗重復6次。

（2）檢測條件

色譜條件為：BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相A為水（含0.1%甲酸），流動相B為乙腈∶異丙醇（1∶1）（含0.1%甲酸），流速為0.45 mL/min，進樣量為20 μL，柱溫為40 ℃，洗脫條件見表1。

表1 發酵薏米乳樣品的流動相洗脫梯度Table 1 Mobile phase elution gradient of fermented coix beverage

質譜條件：樣品質譜信號采集分別采用正負離子掃描模式，電噴霧毛細管電壓，進樣電壓和碰撞能量分別為20～40 V和6 eV。離子源溫度和去溶劑溫度分別為100 ℃和350 ℃，載氣流量：800 L/h，質譜掃描范圍：50～1 000m/z[26]。

（3）質控

質控（quality control，QC）樣品由所有檢測樣品混合而成，在儀器分析的過程中，每10個分析樣品插入一個QC樣品。

1.3.6 統計分析

所得數據為三次獨立重復試驗的平均值，誤差采用標準偏差（standard deviation，SD）表示。數據采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析和Duncan多重比較法分析，圖表采用Excel 2013繪制。

代謝組學數據處理：原始數據導入代謝組學處理軟件progenesis QI（Waters Corporation，Milford，USA）進行處理，最終得到一個保留時間、質荷比和峰強度的數據矩陣，保留非零值50%以上的峰；并對樣品數據進行主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discriimination analysis，OPLS-DA）分析；采用HMDB、METLIN等代謝組數據庫（http：//www.hmdb.ca/;https：//metlin.scripps.edu）進行鑒定。

2 結果與分析

2.1 發酵菌種對發酵薏米乳中營養物質含量的影響

由表2可知，不同菌種對發酵薏米乳的蛋白質、脂肪、可溶性固形物含量沒有顯著影響（P＞0.05）。說明發酵菌種的改變不會引起薏米乳產品蛋白組、脂肪、可溶性固形物含量的總體變化。而對薏米乳樣品中的多糖、三萜類化合物含量有一定的影響。其中經植物乳桿菌發酵的薏米乳中三萜類化合物含量較高，為26.19 mg/L，經保加利亞乳桿菌發酵的薏米乳中多糖含量較高，為34.17 mg/L。

表2 發酵菌種對發酵薏米乳產品營養成分及功能物質含量的影響Table 2 Effect of fermentation strains on the content of nutrients and functional substances in fermented coix beverage

2.2 發酵菌種對發酵薏米乳質構特性的影響

表3 發酵菌種對發酵薏米乳質構特性的影響Table 3 Effect of fermentation strain on texture characteristics of fermented coix beverage

由表3可知，不同菌種發酵可以改變發酵薏米乳的質構特性，總體來看，經保加利亞乳桿菌發酵的薏米乳其粘力、膠著性以及黏度較大（P＜0.05），說明保加利亞乳桿菌發酵的薏米乳產粘性物質較多，薏米乳的結構較緊密，產品較穩定，而經植物乳桿菌發酵的薏米乳產品結構較松散，瑞士乳桿菌發酵的薏米乳質構特性居中。該結果表明了使用保加利亞乳桿菌發酵的薏米乳質構特性較好。

2.3 發酵菌種對發酵薏米乳電子舌味感的影響

對不同菌種發酵的發酵薏米乳樣品進行電子舌味感分析，結果如圖1所示。

圖1 不同菌種發酵薏米乳電子舌味感雷達圖Fig.1 Radar chart of electronic tongue taste of fermented coix beverage by different strains

從圖1可以看出，不同發酵菌種發酵的薏米乳的味感指標存在明顯差異，其中甜味、酸味、鮮味差異偏大（P＜0.05），苦味、澀味無明顯差異（P＞0.05）。經瑞士乳桿菌發酵的薏米乳顯出較大的鮮味，保加利亞乳桿菌發酵的薏米乳甜味值和酸味值相對較高（P＜0.05）。而保加利亞乳桿菌和植物乳桿菌發酵的薏米乳鮮味相似，沒有明顯差異（P＞0.05）；瑞士乳桿菌和植物乳桿菌發酵的薏米乳甜味和酸味相似，無明顯差異（P＞0.05）。

對于不同發酵菌種發酵的薏米乳樣品味感值的差異產生原因可能是不同菌種的代謝產物不同導致的。保加利亞乳桿菌通常被用于酸奶的發酵中，其在牛乳中進行發酵，可以產生二乙酰和乙醛等香氣成分，從而產生獨特的口感[27]。試驗中，保加利亞乳桿菌發酵的薏米乳酸味值較高可能由于保加利亞乳桿菌更加適于在薏米乳中發酵，發酵條件適宜，生長速度較快，所以產酸增多，導致薏米乳酸味值較大。而瑞士乳桿菌有較好的發酵適應性，其發酵代謝的薏米乳中可能產生大量鮮味物質。

2.4 發酵菌種對發酵薏米乳代謝產物的影響

2.4.1 發酵薏米乳樣品主成分分析

分別對保加利亞乳桿菌、瑞士乳桿菌以及植物乳桿菌發酵的發酵薏米乳樣品進行非靶向代謝組學的測定，對得到的數據進行主成分分析，可以得出三種不同發酵菌種發酵的薏米乳樣品的差異性結果見圖2，其中距離越大代表薏米乳樣品間的差異越大。由圖2可知，質控樣本點基本重合，可以得出試驗的穩定性較高，具有可靠性。三組樣品組間顯示較大區別，組內顯示出了一定的聚集性。特別地，植物乳桿菌發酵的薏米乳樣品與其他兩組樣品差異較大，而保加利亞乳桿菌和瑞士乳桿菌發酵的薏米乳差異較小。說明經植物乳桿菌發酵的薏米乳與其他兩組樣品的代謝產物差異較大，為下面的進一步分析提供了可視化的依據。

圖2 正負離子模式下不同菌種發酵薏米乳樣品主成分分析得分圖Fig.2 Principal component analysis score chart of different strains of fermented coix beverage in positive and negative ion mode

2.4.2 不同菌種發酵薏米乳樣品的差異代謝產物分析

三組薏米乳樣品差異代謝集Venn圖見圖3。由圖3可知，重疊部分表示多個分組共有的差異代謝產物數目，沒有重疊部分代表了差異代謝組中所特有的差異代謝物數目。該圖從宏觀上反映了代謝產物的特性。其中植物乳桿菌中有31種特有的差異代謝產物。此外，三組差異代謝產物所共有的代謝產物有38種，說明此38種代謝產物受發酵菌種的種類影響較大。

圖3 不同菌種發酵薏米乳樣品維恩圖Fig.3 Venn diagram of fermented coix beverage by different strains

不同菌種發酵的薏米乳樣品的差異代謝產物聚類熱圖見圖4。

圖4 不同菌種發酵的薏米乳樣品差異代謝產物聚類熱圖Fig.4 Heat map of differential metabolites in fermented coix beverage by different strains

通過對不同菌種發酵的薏米乳樣品進行非靶向代謝組學分析，共檢測到了947種差異代謝產物，采用T檢驗結合正交最小偏二乘判別分析的方法，篩選出組間差異代謝物（同時滿足VIP＞1，P＜0.05），并對其進行鑒定。由圖4可知，從總體上來看，植物乳桿菌發酵的薏米乳中代謝產物與其他兩組差異較大，該結果與PCA相符。其中經植物乳桿菌發酵的薏米乳樣品與保加利亞乳桿菌發酵的薏米乳樣品相比，共檢測出121種差異代謝產物。植物乳桿菌發酵的薏米乳樣品與瑞士乳桿菌發酵的薏米乳樣品相比，共檢測出97種差異代謝產物。其中植物乳桿菌發酵的薏米乳樣品中代謝產物與其他兩組樣品相比，均呈顯著上調的差異代謝產物41種，包括短肽：精氨酸-谷氨酸-精氨酸-甘氨酸（Arg-Gln-Arg-Gly）；精氨酸-丙氨酸-賴氨酸-色氨酸（Arg-Ala-Lys-Trp）；脯氨酸-異亮氨酸-脯氨酸（Pro-Ile-Pro）；L-苯丙氨酸-L-脯氨酸（L-Phe-L-Pro）；吲哚乙酸、泛酸、亞油酸、β-檸檬酰-L-谷氨酸；脂類：腦磷脂（即磷脂酰乙醇胺，phosphatidyl ethanolamine，PE）（16∶1（9Z）/P-18∶1（11Z））、PE（16∶1（5Z）/16∶1（5Z））、PE（15∶0/22∶4（7Z，10Z，13Z，16Z））等。其中均呈顯著下調的差異代謝產物23種。

通過對不同發酵菌種發酵的薏米乳樣品進行非靶向代謝組學分析可以得出，與其他兩組相比植物乳桿菌發酵的薏米乳中的短肽類物質顯著增加，脂類物質有所減少。這可能是植物乳桿菌的發酵可以更多分解薏米乳中的蛋白質轉化成短肽以及氨基酸等物質。短肽是薏米乳中的功能性物質，研究表明短肽具有降血壓、抗氧化等多種功能性作用[28]，通過植物乳桿菌的發酵，其短肽的增多也一定程度地表明了植物乳桿菌發酵的薏米乳更具有營養價值。

3 結論

本研究分別對不同菌種發酵薏米乳產品的品質特性及差異代謝產物進行了較全面的分析，研究了菌種對薏米乳發酵產生的影響。植物乳桿菌發酵的薏米乳可以增加薏米乳中的三萜類化合物含量，保加利亞乳桿菌發酵可以增加薏米乳中的多糖含量；從發酵薏米乳的品質特性可以看出，保加利亞乳桿菌發酵的薏米乳具有較好的粘力、膠著性以及黏度，結構穩定性高；瑞士乳桿菌發酵的薏米乳口感較好。代謝組學技術可以得到全面準確性較高的差異代謝產物，為研究不同菌種對發酵薏米乳中代謝產物的影響提供理論依據。正負離子掃描下的基峰圖顯示三種不同發酵菌種發酵的薏米乳峰圖存在較大差異，其中非靶向代謝組學試驗共檢測出947種代謝產物，其中植物乳桿菌發酵的薏米乳樣品中檢測到更多的短肽類化合物、吲哚乙酸、泛酸、亞油酸、β-檸檬酰-L-谷氨酸以及腦磷脂PE（16∶1（9Z）/P-18∶1（11Z））、PE（16∶1（5Z）/16∶1（5Z））、PE（15∶0/22∶4（7Z，10Z，13Z，16Z））等多種功能性成分，說明植物乳桿菌發酵的薏米乳營養價值相對較高。