醋酸菌粉末對ICR小鼠的酒精性肝脂質蓄積和氧化應激的影響研究

田思敏，陳小雪，韓北忠

（中國農業大學 食品科學與營養工程學院 農業農村部葡萄酒加工重點實驗室，北京 100083）

飲酒的傳統古來有之，有報告稱全世界最早的酒精飲品誕生于中國[1]，研究表明少量飲酒能降低死亡率[2]，但是飲酒過度會損害健康[3]。中國的酒精性肝疾病患者正在增多[4]，健康飲酒的基礎教育成為當務之急。飲酒導致肝損傷的背景是氧化應激上升，其中長期酗酒和過量狂飲都存在有害性，為此人們正在進行多方面的研究[5-7]。研究結果顯示酒精在通過肝臟代謝的過程中會產生活性氧類（reactive oxygen species，ROS）[8]，過度的活性氧會使肝臟中的抗氧化物質枯竭，導致氧化應激并由此導致細胞損傷。酒精性肝損傷在人體上的癥狀有：肝臟脂肪蓄積、肝臟纖維化、肝硬化，甚至肝癌。酒精在人體內主要通過乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）和乙醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）來分解，有報告稱ADH和ALDH可減輕氧化應激[9]，已有研究表明，通過攝取醋酸菌可以減輕攝取乙醇對肝臟造成的損傷[9]。

醋是自古以來餐桌上常用的調味料，除了具有調味的功能之外，其還具有抑制血壓升高和促進鈣吸收等保健功能，還有報告稱一部分的醋具有醒酒[10]和減輕酒精性肝損傷的功能[11-12]。醋是通過對酒精進行醋酸發酵制得的，其代謝是通過ADH和ALDH途徑進行的。醋的制造工藝與人體酒精代謝的類似性，或許在醋的制造過程中產生的具有ADH和ALDH活性的組分，能夠促進酒精分解，減輕酒精性肝損傷。前期研究已經證明攝入醋酸菌可減輕因使用乙醇誘發的血清谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶升高和脂肪在小鼠肝臟中的蓄積[13]。本研究以“醋酸菌粉末”（acetic acid bacterial powder）為研究對象，建立動物實驗模型，評估其對急性攝入酒精引起的肝脂質蓄積和氧化損傷的影響，為開發新型減緩酒精性肝損傷的營養輔助食品提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品信息

醋酸菌粉末：由丘比株式會社提供，-20 ℃冷凍保存。

1.1.2 實驗動物與飼料

選用北京維通利華實驗動物技術有限公司（SCXK（京）2016-0006）提供的無特定病體（specific pathogen free，SPF）級雄性美國癌癥研究所（institule of cancer research，ICR）小鼠，共25只，體質量28～30 g，適應環境5 d后，進行實驗。按體質量進行隨機分組，每組5只。所有動物實驗均以實驗動物飼養和儲存以及疼痛緩解標準為基礎，經CAIQtest動物研究委員會審核批準。

飼養條件：溫度：20～26 ℃；相對濕度：40%～70%；亮暗循環：明暗交替時間12 h/12 h，早8點到晚8點。

飼料：斯貝福（北京）生物技術有限公司（許可證號：SCXK（京）2015-0015）。

1.1.3 試劑

鐵氰化鉀（純度＞99.0%）、乙醇（純度＞99.5%）、檸檬酸（純度＞99.0%）、磷酸氫二鈉（純度＞99.0%）、硫酸鐵（III）n水合物（60.0%～80.0%）、磷酸：日本關東化學株式會社；十二烷基硫酸鈉（純度＞95.0%）：日本FUJIFILM公司；麥基爾文緩沖液（pH=5）由檸檬酸和磷酸氫二鈉制備；Dupanol溶液由硫酸鐵（III）n水合物、十二烷基硫酸鈉和磷酸配制。

丙二醛（malondialdehyde，MDA）測定試劑盒、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）測定試劑盒：南京建成科技有限公司；甘油三酸酯（triglyceride，TG）測定試劑盒：中生北控生物科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

SynergyHIM多功能酶標儀：美國伯騰儀器有限公司（BioTek）、TBA120FR全自動生化分析儀：日本東芝有限公司；S10型手提式高速分散器：寧波新芝生物科技股份有限公司）、CM1850冰凍切片機：德國Leica有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動物實驗方法

根據現有報道[14]改良了乙醇的給予方法。連續5 d的適應期結束后，試驗前1d，動物稱質量，實施預飼養后將其分為對照組，乙醇組，樣品7.5 mg/kg組，15.0 mg/kg組，45.0 mg/kg組，共計5組。陰性對照組灌胃給予植物油（0.01mL/10 g）；乙醇組灌胃給予植物油（0.01 mL/10 g）和體積分數50%乙醇（0.12 mL/10 g）；乙醇＋醋酸菌粉末組灌胃給予體積分數50%乙醇（0.12 mL/10 g）和三種不同劑量的受試樣品。禁食不禁水16 h，稱質量后處死動物，稱體質量。

1.3.2 生化學分析

取0.5 g肝臟制成10%肝勻漿，取0.1 mL肝勻漿液參照試劑盒說明書測定MDA含量，10%肝勻漿液，3 000 r/min離心10 min，取上清液0.5 mL，參照試劑盒說明書測定GSH的含量，取上清液0.5 mL使用全自動生化儀測定TG含量。

1.3.3 組織學分析

從肝左葉中部做橫切面取材，冰凍切片，油紅O染色[15]，從肝臟的一端視野開始記錄細胞的病理變化，用40倍物鏡連續觀察整個組織切片。

1.3.4 乙醇脫氫酶（ADH）、乙醛脫氫酶（ALDH）酶活性測定

根據現有報道[16]改良了酶活性測定方法。用微量吸管快速添加100 μL 醋酸菌粉末溶液，將空白樣換成純水100 μL。用觸摸式磁力攪拌器輕輕攪拌，放在微量恒溫器中（35 ℃）。5 min后，用微量吸管快速加入100 μL 0.1 mol/L鐵氰化鉀溶液。用觸摸式磁力攪拌器輕輕攪拌，放回微量恒溫器（35 ℃）。按一定間隔（10～20 s左右）進行添加。20 min后，用微量吸管快速加500 μL Dupanol溶液。用觸摸式磁力攪拌器輕輕攪拌，放在常溫下。所有樣品添加Dupanol溶液后，用微量吸管吸取反應液400μL，添加在準備好的1 000μL純水中。用觸摸式磁力攪拌器輕輕攪拌，放在常溫下待測定。添加Dupanol 20 min后，用分光光度計測定波長660 nm下的吸光度值。以鐵氰化鉀含量（x）為橫坐標，OD660nm值（y）為縱坐標繪制鐵氰化鉀標準曲線。

1.3.5 酶活性值計算

在37 ℃條件下，在1 min內將1 μmol乙醇氧化所需要的酶量為1 U。將0.1 mL 1 mg/mL的醋酸菌粉末溶液稀釋D倍，反應20 min后進行活性測定，醋酸菌粉末底物為乙醛時，比酶活計算公式如下：

比酶活（U/mg干細胞）=A/d×D/20

式中：A為波長660 nm處的吸光度值，d為鐵氰化鉀標準曲線斜率，D為稀釋倍數。

底物為乙醇時，會通過ADH分節生成乙醛，因此同時會檢出ALDH活性。這里假設活性值的1/2是ADH活性。如果只關注醋酸菌粉末量，比酶活計算公式如下：

比酶活（U/mg干細胞）=A/d×0.1×1/T×1/E

式中：T為反應時間，min；E為醋酸菌粉末質量，mg。

1.3.6 統計學分析

使用IBM SPSS Statistics 19.0統計分析軟件進行統計學分析。數據采用方差分析，計算F值，F值＜F0.05，則各組均數間無顯著性差異；F值≥F0.05，P≤0.05，則各組均數間存在顯著性差異。用多個實驗組和一個對照組均數的兩兩比較方法進行統計；對非正態或方差不齊的數據進行適當的變量轉換，待滿足正態或方差齊要求后，用轉換后的數據進行統計；若變量轉換后仍未達到正態或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統計。

2 結果與分析

2.1 小鼠體質量水平

通過對實驗小鼠體質量的測定，并對其進行顯著性差異分析，結果見表1。經統計學分析，其體質量在各劑量組與乙醇組間比較，均無顯著性差異（P＞0.05）。這說明實驗過程中使用的小鼠體質量差異對后續實驗結果無顯著性影響。

表1 小鼠體質量測定結果Table 1 Determination results of body mass of mice

2.2 肝臟TG水平及油紅O染色

甘油三酯（TG）是人體脂質的主要組成成分，血清中TG含量是誘發心血管疾病的危險因素，TG含量越高誘發心血管疾病的可能性越大[7，17]。小鼠肝勻漿TG含量的測定結果見圖1。

圖1 不同處理組對小鼠肝臟甘油三酸脂的影響Fig.1 Effects of different treatment groups on triglycerides in mice liver

由圖1可見，經統計學分析，乙醇組與對照組比較，肝臟TG濃度顯著升高（P＜0.01），可判定造模成功。1次灌胃給予受試物后，醋酸菌粉末給予組的TG水平低于乙醇給予組，差異具有顯著性（P＜0.01），且45.0 mg/kg組小鼠的TG水平幾乎與空白對照組持平。

取不同處理組的小鼠肝臟，經冰凍切片油紅O染色結果見圖2。

圖2 不同處理組小鼠的油紅染色結果（×40）Fig.2 Oil red staining results in different treatment groups of mice

由圖2可知，對照組小鼠肝臟脂滴形成較少，細胞呈散在分布；乙醇組小鼠肝臟內彌漫性脂肪變性，大部分肝細胞內充滿大小不等、分布不均的脂滴空泡，部分融合呈片狀并分布于肝細胞內，脂滴在肝臟中的分布、范圍均高于對照組；45.0 mg/kg組脂肪變性情況有所減輕，脂滴空泡較小，但仍呈彌漫性分布。通過組織學分析，乙醇組小鼠肝臟中存在脂質蓄積的現象，與乙醇組相比，45.0 mg/kg組小鼠肝臟中脂質蓄積程度較輕，說明醋酸菌粉末對酒精引起的脂質蓄積具有緩解作用。

本研究使用的急性模型是用單次喂食0.12 mL/10 g的體積分數50%乙醇來模擬過量狂飲。急性過度攝入乙醇導致的肝臟脂肪蓄積是短暫可逆的[17]。結果表明，醋酸菌粉末具有減輕因過量狂飲導致的肝臟脂肪蓄積和氧化應激的可能性。因此攝入醋酸菌粉末會有效減輕日常攝入酒精飲料導致的肝臟脂肪蓄積。

2.3 肝臟MDA及GSH水平

已有研究闡明，為了應對乙醇代謝過程中產生的氧化應激，抗氧化物質GSH會減少[17]。不同處理組的小鼠肝臟MDA以及GSH水平見表2。

表2 各組小鼠中肝臟丙二醛、谷胱甘肽水平Table 2 Levels of malonaldehyde andglutathione in mice liver of each groups

由表2可見，經統計學分析，乙醇組與對照組比較，肝臟MDA濃度顯著升高（P＜0.05），GSH濃度顯著降低（P＜0.05），可判定造模成功。1次灌胃給予受試物后，15.0 mg/kg組以及45.0 mg/kg組的GSH水平高于乙醇組，差異均具有極顯著性（P＜0.01）；其MDA水平在各劑量組與乙醇組間比較，差異均無顯著性（P＞0.05）。

在本研究中，醋酸菌粉末對抗氧化物質GSH的減少有抑制作用，卻不影響氧化生成物MDA。這是因為對氧化應激的防御反應途徑有多種，GSH與MDA并非一一對應關系[18]，具體的代謝機理還有待進一步闡明。

2.4 醋酸菌粉末酶活性測定以及作用效果

鐵氰化鉀的標準曲線見圖3。由圖3可知，標準曲線的回歸方程為y=0.194 7x-0.002 7，二者線性良好（R2=0.999 4）。本研究中測定的醋酸菌粉末的ADH和ALDH活性分別是0.48 U/mg和1.38 U/mg。

圖3 鐵氰化鉀的標準曲線Fig.3 Standard curve of potassium ferricyanide

此次試驗中使用的小鼠體質量約30 g，胃排泄時間約180 min[19]。根據此次喂食的乙醇量與酶活性進行換算，推測醋酸菌粉末中的酶分解了喂食的180 mg乙醇中的約0.9～5.5 mg（占喂食量的0.5%～3.0%）。將這一結果與醋酸菌粉末的作用強度（減輕肝臟TG蓄積30%～55%）進行對比，可以推測醋酸菌粉末依靠ADH和ALDH對乙醇的分解作用，以及ADH和ALDH對細胞氧化應激的減輕作用[9，20]，有助于減輕肝臟TG蓄積。結果表明，在單次喂食乙醇的同時喂食醋酸菌粉末，可減輕因乙醇導致的肝臟脂肪蓄積。

3 結論

本研究通過模擬急性酒精攝入，構建動物模型評估了醋酸菌粉末對急性攝入酒精引起的肝脂質蓄積和氧化損傷的影響。結果表明，與對照組相比，乙醇組肝臟中TG、MDA濃度顯著升高（P＜0.05），GSH濃度顯著降低（P＜0.05），小鼠肝臟脂肪變性嚴重；（乙醇＋45.0 mg/kg醋酸菌粉末）組的TG濃度顯著低于乙醇組（P＜0.01），GSH濃度極顯著高于乙醇組（P＜0.01）；脂肪變性情況有所減輕；各劑量組的MDA濃度與乙醇組比較，差異均無顯著性（P＞0.05）。醋酸菌粉末的ADH和ALDH酶活性分別為0.48 U/mg和1.38 U/mg。攝入醋酸菌粉末可以減輕急性攝入酒精引起的肝脂質蓄積和氧化損傷。

研究報告稱有數種能夠減輕酒精性肝損傷的天然成分，它們的作用大都是憑借抗氧化能力發揮的。而醋酸菌粉末與其他成分相比，其獨到之處是能夠降低呼氣和血液中的酒精濃度。將醋酸菌粉末與具有抗氧化作用的天然成分相結合，有望發揮加乘效果。進一步減輕因過量狂飲導致的肝臟脂肪蓄積和氧化應激現象。