生物發酵法生產丁醇的優化策略

陳繼良，蔡林洋

（湖北工業大學 生物工程與食品學院，湖北 武漢 430068）

化石燃料是一種不可再生能源，隨著化石燃料的日益枯竭，可再生能源受到了越來越多的關注，而生物丁醇具有可再生性、熱值高、蒸氣壓低、腐蝕性小等[1]優點，可以替代部分的化石燃料，受到了廣泛的關注。丁醇的生產方式主要有化學合成法與生物發酵法，化學合成法主要有丙烯羰基合成法與乙醛醇醛縮合法[2]，原料的來源依然是化石燃料，而生物發酵法利用葡萄糖、纖維素、淀粉等可再生的物質作為原料，通過微生物發酵生產丁醇，具有可再生的優勢。糧食安全一直是國家關注的重點，隨著發酵工業的發展，糧食類原料價格不斷在提高，越來越多的非糧原料被投入到丁醇的生產中，如稻草[3]，甚至有一些是工業生產的廢棄物，如生產乙醇的廢糟[4]。這些原料存在成分復雜，營養成分及比例不適宜，淀粉與還原糖含量低，抑制物多等問題；加上菌株對原料的利用能力差，對溶劑的耐受能力差，嚴格厭氧等問題。另外，沒有合適的發酵工藝相匹配，導致在丁醇發酵過程中存在菌株無法正常生長、副產物過多、丁醇產量低等問題[5]。該文將從菌種、培養基配方、培養工藝三個方面總結一些已有的生產丁醇的優化策略，為改善發酵法生產丁醇與提高丁醇生產效益提供參考。

1 優化菌種

1.1 高產菌株的篩選

近些年來，分離篩選丁醇生產菌的工作一直在進行，新發現菌株盡管在丁醇的產量上很難有提高，但是菌株擁有的新性狀有利于在丁醇發酵工業中應用，提高生產效益，一些丁醇生產菌的報道情況如表1所示。

表1 一些丁醇生產菌的報道Table 1 Partial report of butanol producing strains

誘變育種是在已經獲得了能夠生產丁醇的菌的基礎上，通過添加誘變劑的方式來提高菌的遺傳物質在復制過程中的錯配機率，并將這些發生變異的遺傳信息遺傳給后代，通過一定的分離篩選手段得到具有優良性狀的菌的育種方式，一些丁醇生產菌誘變育種的報道見表2。誘變育種操作簡單，被廣泛的運用在菌種的改良中，通過這種方式有一定的機率可以得到性狀優良的菌株，但是突變結果具有隨機性，無意義的突變占絕大部分，試驗的盲目性大，工作量也龐大。

表2 一些丁醇生產菌誘變育種的報道Table 2 Partial report on mutation breeding of butanol producing strains

1.2 代謝途徑的分子修飾或改造

野生型丁醇生產菌最常被報道的代謝產物有乙醇、乙酸、丙酮、丁酸、丁醇這些物質，這些物質的產生途徑如圖1所示，每種代謝產物都需要利用前體物質丙酮酸去合成，因此，減少副產物的生成與增加丁醇的生成是提高丁醇產量的一個重要方向。另外，菌株專性厭氧，對丁醇的耐受能力不高也是丁醇生產工業的一個障礙[16]。目前，主要從兩個方面修飾或改造菌種的代謝途徑：一種是從碳源的流向入手，改造糖酵解途徑（embden-meyerhof pathway，EMP）代謝途徑，使用于丙酮-丁醇-乙醇（acetone-butanol-ethanol，ABE）合成的前體物質過表達，阻斷丙酮、乙酸及丁酸這些副產物的代謝途徑，減少碳源流入副產物，一定程度上可以將更多的碳源流入到生成丁醇的代謝中；另一種是提高菌株對發酵環境的適應能力，解除其他基因對菌體生長與產物合成的抑制作用，如提高菌株對丁醇的耐受性與對氧氣的耐受能力，使菌株更加適應發酵環境，從而達到改善發酵的作用。一些通過分子手段修飾或改造代謝途徑的報道見表3。

圖1 丁醇生產菌的代謝途徑[24]Fig.1 Metabolic map of butanol-producing bacteria

表3 部分關于代謝途徑通過分子手段修飾或改造的報道Table 3 Partial report on molecular means of modification or modification of metabolic pathway

相比于傳統的誘變育種，利用分子改造或修飾菌株的方式目的性強，可以促進有利于產物生成的基因的表達，阻斷或抑制非必需的副產物基因的表達，提高菌株適應性。然而丁醇梭菌的代謝途徑復雜，需要考慮通過基因的過表達、敲除、重組等方式進行修飾改造菌株對其生長代謝帶來的影響。各個代謝途徑存在著相互聯系，丁醇梭菌本身專性厭氧，會增加分子試驗操作的難度。

1.3 構建工程菌株

基因工程手段通常也被用于菌種的改良，該方法能夠借助工程菌的優勢。該方法通常是將與丁醇代謝相關的基因片段導入到特性優良的宿主細胞體內，并將導入的基因在宿主細胞體內表達。通常生物發酵法生產丁醇有兩種途徑[25]，一種是輔酶A（coenzyme A，CoA）依賴途徑，類似于脂肪酸在生物體內的合成方式，梭菌先將乙酰CoA合成丁酰CoA，然后將丁酰CoA還原成正丁醇，這是野生菌最常見的丁醇代謝方式，例如丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、糖丁酸梭菌與糖乙酸多丁醇菌。該方式也被用于構造丁醇生產的工程菌株，如LAN E I等[26]將丁醇的CoA依賴途徑相關基因導入藍細菌中表達，構造了一株能夠利用光能合成丁醇的菌株，其中丁醇產量0.014 5 g/L。ZHANG J等[27]將丁醇的CoA依賴途徑部分基因導入酪丁酸梭菌，構造了一株對丁醇耐受能力強的菌株，通過分批發酵丁醇產量達26.2 g/L；YANG X R等[28]將醛/醇脫氫酶基因（edhE2）引入纖維素分解菌嗜纖維桿菌（Clostridium cellulovorans），其能夠將丁酰-CoA轉化為正丁醇和乙酰-CoA轉化為乙醇，構造的菌株可以直接利用纖維素生產正丁醇，產量為1.42 g/L。另一種是2-酮酸途徑，生物體內的蘇氨酸被用于中間產物2-酮丁酸的生產，然后中間產物被脫羧還原產生正丙醇與正丁醇，一般這種途徑用于異源表達，代謝副產物少，如利用大腸桿菌重組菌株BW25113就是利用這一途徑，丁醇產量達0.8 g/L[29]。

將涉及丁醇代謝的關鍵基因轉移到特性優良的宿主體內進行異源表達，其他方面加以調整，具有生產丁醇的潛力與可行性。這種生產方式能夠借助宿主細胞的優良特性，使得能夠用于丁醇發酵的原料種類增多，同時對發酵環境具有強的適應能力，然而丁醇代謝相關的基因在宿主體內的兼容性也是不可忽略的，增加了改造的難度。

2 優化培養基配方

微生物生產丁醇的代謝網絡復雜，通常提高或降低某些物質的含量就可以影響某些代謝途徑的表達量，從而影響丁醇的產量。隨著研究深入，已經有報道表明，適量地添加氨基酸[30]、醋酸銨[31]、丁酸根[32]、乙酸根[33]、鋅離子、鈣離子、鐵離子[34]等對丁醇產量有提高的作用，各物質存在相互影響，適宜的物質配比能夠得到更高的丁醇產量。借助數理統計工具就可以通過少量的試驗數據模擬生物發酵過程，建立發酵的數學模型。再借助分析工具分析模型就能得到培養基中影響顯著的成分及其適宜的添加量，從而達到提升丁醇產量的目的。

2.1 回歸分析模擬優化

響應面是回歸分析模型之一，是一個基于二次二階的數學模型。將試驗所得的數據用于擬合一個二次多項式模型方程式，通過顯著性檢驗與方差分析（analysis of variance，ANOVA），分析參數及其相互作用對輸出結果的影響[35]，用相關系數R2值評估多項式模型的可靠性。通過擬合的多項式方程通過繪制三維表面圖，可以觀察到兩兩因素之間的相互作用關系，通過回歸方程可以精確得到最優的培養基配方及相應的預測結果。NAJEEB K N S等[36]采用中心組合設計來提高丁醇的產量，以木薯為原料，按照中心組合設計添加葡萄糖與丁酸以及調整C/N比例，將試驗結果用于擬合模型，按照模型得出添加葡萄糖與丁酸含量以及調整C/N比例分別是50 g/L、10 g/L、12.8，預測的丁醇產量13.82 g/L，發酵驗證的丁醇產量是13.87 g/L，高于優化前的最高產量9.48 g/L。

2.2 神經網絡模擬與遺傳算法優化

人工神經網絡是一種人工模擬大腦運行用于處理某種信息的系統，被用于廣泛運用于微生物的培養基優化上[37-38]。遺傳算法則是模擬自然進化，在合理范圍內隨機產生培養基配方，并將這些配方帶入訓練有素的神經網絡模型，多次篩選變異之后，就能得到一個相對較優的優化結果以及相應的配方。相比于響應面來說，采用神經網絡建模預測結合遺傳算法優化具有更高的準確性，SALIM N等[39]使用人工神經網絡對菌株Trichoderma harzianum建立發酵模型，采用遺傳算法從模型中找到最優培養的條件，蛋氨酸酶預測值是33.76 U/mg，預測的配方是乳糖、L-蛋氨酸、KH2PO4、K2HPO4、ZnCl2分別加13.9 g/L、11.37 g/L、1.58 g/L、3.98 g/L、0.01 g/L。某些物質對于菌的影響來說并非符合二次連續函數模型，閾值函數的加入適用于處理這類非連續的數學模型，其擬合的模型能夠更加吻合生物發酵的特征。

3 優化發酵工藝

除了優化培養基配比外，丁醇梭菌的培養工藝同樣重要。菌株對丁醇的耐受性沒有很大提高[40]，限制了丁醇產量的進一步提高；越來越多的非糧原料用于丁醇的生產，存在菌株對原料的利用能力差的問題，各種處理會釋放原料中的抑制物，都會影響丁醇的生產[41]，采用合適的培養工藝可以緩解這些問題。

3.1 產物原位提取

丁醇梭菌的代謝產物有許多，如乙醇、乙酸、丙酮、丁酸、丁醇等，其中丁醇對菌株的抑制性最大，正丁醇影響膜的脂質組成，流動性與電位，并且能夠中斷細胞的磷脂雙分子層[42]。原位提取是一個避免高濃度產物對菌體有毒害作用的方式，將發酵產物丁醇脫離發酵體系，這樣能夠實現在營養物質足夠的情況下，菌株能夠源源不斷地生產丁醇。一種方式是利用一些物質對于水與丁醇的溶劑度不同構建雙相系統，如利用丁醇易溶于有機溶劑可以液-液萃取[43]、活性炭對丁醇吸附丁醇能力強，可以用吸附[44]、丁醇比水易溶于空氣，通過通氣的方式將丁醇攜帶出發酵體系，可以用氣提[45]等。另一種是利用一些材料對水和丁醇的選擇透過性不同可以將丁醇從發酵體系中分離，如膜蒸發[46]、滲透[47]與反向滲透[48]。原位提取能夠很好回避丁醇對菌的毒害作用，然而最大的問題在于尋找合適的提取分離體系，要求溶劑收集相能夠對發酵產生的溶劑溶解度足夠大，并與發酵液互不相溶，對菌體無毒無害，易于分離，或者材料對丁醇的選擇透過性高，其營養物質不能透過膜。

3.2 共培養發酵

目前報道的用于生產丁醇的菌絕大多數是厭氧菌，以木質纖維素為原料進行發酵生產丁醇的方式受到了越來越多的關注。木質纖維素難以被丁醇梭菌所利用，水解過程會產生大量的抑制物[41]，通過與其他微生物共培養，可以為丁醇梭菌制造厭氧環境[49]，更重要的是讓其他微生物先行分解這類難以利用的大分子物質為一些容易吸收利用營養物質，中間代謝產物，生長因子等[50]，協助丁醇梭菌對原料中營養物質的吸收利用，同時，協助分解一些抑制物，從而達到提高丁醇產量的目的。ALEJANDRA G O R等[51]使用龍舌蘭水解液作為原料，丙酮丁醇梭菌與枯草芽孢桿菌共培養丁醇產量達8.2 g/L，而丙酮丁醇梭菌單獨發酵產量是6 g/L，提高了36.7%。LI L等[52]使用甘蔗糖蜜作為原料，將拜氏梭菌與酪丁酸梭菌共發酵生產丁醇產量達12.1 g/L，而單獨使用拜氏梭菌發酵產量是11.2 g/L，提高了8%。另外，研究還發現，通過丁醇梭菌與其他菌共培養的方式生產丁醇的產量，高于直接在發酵培養基中添加這些物質的方式與直接發酵的方式，一方面原因是人為添加這些物質的時機沒有共培養微生物代謝產生的好；另一方面是受技術水平的限制，共培養微生物產生的一些物質對丁醇梭菌產丁醇有提高作用，但由于其含量極低，在其以往的研究過程中并沒有被發現，這類物質在培養基上的添加往往會被忽略掉。

一些研究發現，在食物匱乏或者營養物質不全的條件下，丁醇梭菌能夠與其他菌互利共生，兩者不僅能夠在體外進行營養物質代謝產物的交換，而且還能夠進行細胞質中的物質交換。SAIDA B等[53]研究發現，丙酮丁醇梭菌與脫硫弧菌能夠互換細胞質中的物質，脫硫弧菌的存在使得丙酮丁醇梭菌生長的更好。

3.3 兩階段發酵

大多數的丁醇梭菌在生產丁醇的過程中存在著產酸與產醇兩個階段，產醇階段可以利用產酸階段產生的部分有機酸轉化為醇[54]。也有研究表明，將有機酸在發酵前加入培養基中，可以提高丁醇梭菌對丁醇的耐受性，提高丁醇的產量[55]。分階段發酵就是利用產酸菌先將部分難以分解利用的碳源轉化為丁醇梭菌容易吸收利用的有機酸，然后丁醇梭菌將這些酸轉化為丁醇；另外，產酸菌還可以降解原料中存在的一些抑制物，促進丁醇梭菌的生長代謝。LI J Z等[56]使用稻草作為生產丁醇的原料，先利用產酸菌發酵產生乙酸與丁酸，然后利用拜氏梭菌發酵生產丁醇，丁醇產量高達13.8 g/L，高于直接使用拜氏梭菌對原料進行發酵的方式，還高于在原料上添加乙酸、丁酸再使用拜氏梭菌發酵的方式。相比共培養來說，可以避免其他菌對丁醇梭菌產生抑制作用，但是分階段發酵的操作工藝相對復雜，同時也會帶來發酵周期的延長。

4 結論與展望

生物發酵法生產丁醇一直是一個研究的熱點，真正用于工業生產還存在著菌株對產物耐受性差，對原料利用能力差，對發酵環境適應能力差，副產物多等問題。這些問題可以從三個方面找到緩解的策略：

性狀優良的菌種用于發酵是高產目標產物的前提，自然界篩選與誘變育種的操作簡單，是得到性狀優良生產菌的重要途徑，今后的探索依然會繼續。隨著丁醇梭菌代謝方面的研究深入，分子生物學的快速發展，代謝途徑修飾改造或者丁醇代謝基因異源表達的技術越來越成熟，生產菌株可以通過這些方式獲得優良的特性，在提高菌株對產物的耐受性，對原料的利用，對發酵環境的適應，減少副產物的產量，增加目標產物的產量等方面具有廣泛的應用前景，菌種改良的目標比較明確，依舊是今后研究的一個熱點方向。

隨著研究的深入，越來越多的非糧原料用于丁醇生產，成分的多樣性，原料的更新，需要不斷優化配比，今后，借助各種處理工具優化培養基配比的方式將繼續。神經網絡與遺傳算法適合解決一類優化的問題，在其他生物的培養基配比優化方面優于回歸分析，推動該方法在丁醇生產中在培養基配比優化上的運用。

面對復雜的發酵環境，發酵工藝依然是一個研究的熱點，尤其是菌株對發酵產物丁醇的耐受性難以提高的情況下，原位提取工藝結合其他的發酵工藝是一個值得借鑒考慮的工藝優化方式，將會有更多的研究。