松毛菇多酚抗氧化及抑菌活性研究

李彥坡 - 黃 艷 程璐潔 - 孫怡婷 -

(1.溫州市農業科學研究院，浙江 溫州 325000；2.武夷學院茶與食品學院，福建 武夷山 354300；3.福建農林大學食品科學學院，福建 福州 350002)

松毛菇又名灰離褶傘、千佛頭、北風菌、一窩雞等[1]，主要分布于中國吉林、黑龍江、河南、青海、云南、西藏及福建北部地區[2-4]。研究[5-7]表明，松毛菇具有助消化、防治胃腸脹滿和便秘等功效，其提取物對肉瘤和艾氏癌的抑制率高達 80%～90%。目前松毛菇收獲后除鮮食外，大部分被制成干菇、罐頭等加工品，但松毛菇中天然有效成分的研究和開發卻鮮見研究報道，極大地制約了松毛菇的產業發展。

多酚類化合物是廣泛存在于植物中的一類活性物質[8]，不僅具有較強的抗氧化作用[9]，還具有抗炎抑菌[10]、抗癌[11]、抗老化[12]、降血壓和預防心血管疾病[13]等功效，近年來對多酚類物質的研究已引起研究者的廣泛關注[14]。目前已見番石榴[15]、海棠[16]、洋蔥[17]等果蔬多酚及檸檬果皮[18]、玉米須[19]等來源于果蔬副產物的多酚抗氧化和抑菌活性報道，而關于松毛菇中多酚類化合物的抗氧化及抑菌活性的研究尚未見報道。試驗擬在前期松毛菇多酚提取純化研究的基礎上，探究松毛菇粗多酚及純化多酚的體外抗氧化活性及抑菌活性，以期為松毛菇多酚的功能特性及高值化利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗原料

松毛菇：武夷山食用菌技術開發有限公司；

大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)、傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphi)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)：廣東環凱微生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑

沒食子酸、硫酸亞鐵、過氧化氫、鄰苯三酚：分析純，上海展云化工有限公司；

1,1-二苯-2-苦基肼(DPPH)：生物試劑，梯希愛(上海)化成工業發展有限公司；

抗壞血酸：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

平板計數培養基：廣東環凱微生物科技有限公司。

1.1.3 儀器設備

電子分析天平：AE224C型，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；

數控超聲波清洗器：KQ-500DE型，昆山市超聲儀器有限公司；

循環水真空泵：SHZ-DS-Ⅲ型，鞏義市予華儀器有限責任公司；

旋轉蒸發器：RE2000A型，上海亞榮生化儀器廠；

紫外可見分光光度：UC-6100型，上海元析儀器有限公司；

冷凍干燥機：LGJ-10D型，湖南湘儀實驗儀器開發有限公司；

手提式壓力蒸汽滅菌鍋：YXQ-LS-18SI型，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；

氣浴恒溫振蕩器：SHZ-82A型，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；

單人單面凈化工作臺：SW-CJ-1FD型，蘇州凈化設備有限公司；

高速粉碎機：6202型，欣鎮精密企業有限公司。

1.2 方法

1.2.1 松毛菇多酚干品的制備 參照課題組[2]前期研究的方法進行松毛菇粗多酚的提取及純化。粗多酚及純化多酚溶液經真空濃縮、冷凍干燥后分別獲得松毛菇粗多酚和純化多酚干品。

1.2.2 松毛菇多酚體外抗氧化活性

(1)清除·OH能力測定：采用芬頓(Fenton)反應法[20-21]，配制9.0 mmol/L的FeSO4、9.0 mmol/L的水楊酸和8.8 mmol/L的H2O2，以及不同濃度的松毛菇多酚樣品和VC待測液于試管中。分別加入1 mL不同濃度的松毛菇多酚待測液，然后依次加入1 mL FeSO4和2 mL水楊酸溶液，再加入2.0 mL H2O2，充分混合后置于37 ℃下水浴30 min，510 nm處測定吸光度值A1；等體積去離子水替代 H2O2，其余條件一致，測定吸光度值A0；用等體積去離子水替代樣品測定吸光度值A2。以VC為陽性對照，每組試驗平行測定3次，結果取平均值。按式(1)計算·OH清除率。

c={[A0-(A1-A2)]/A0}×100%，

(1)

式中：

c——·OH清除率，%；

A0——無樣品加H2O2(空白對照組)的吸光度值；

A1——加樣品和H2O2測得的吸光度值；

A2——加樣品不加H2O2測得的吸光度值。

c=[(A2-A1)/A2]×100%，

(2)

式中：

A1——含樣品溶液的吸光度值；

A2——不含樣品溶液的吸光度值。

(3)清除DPPH·能力測定：采用DPPH比色法[23]。配制不同濃度的多酚樣品和VC待測液、0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液，在試管中依次加入2.0 mL的待測液和DPPH乙醇溶液，對照管中依次加入2.0 mL的待測液和無水乙醇，空白管中依次加入2.0 mL的DPPH乙醇溶液和無水乙醇。溶液充分搖勻，室溫下避光放置30 min，于517 nm處測定吸光度值，依次記為A1、A2、A0。每組試驗平行測定3次，結果取平均值。按式(3)計算DPPH·清除率。

c={[1-(A1-A2)]/A0}×100%，

(3)

式中：

c——DPPH·清除率，%；

A1——樣品待測液和DPPH乙醇溶液的吸光度值；

A2——樣品待測液和無水乙醇的吸光值；

A0——無水乙醇和DPPH乙醇溶液對應測得的吸光值。

1.2.3 松毛菇多酚抑菌活性

(1)松毛菇多酚溶液制備：稱取一定質量的粗多酚及純化多酚粉末干品，在無菌操作臺上加入無菌蒸餾水溶解，各配制成30 mg/mL的原液，置于冰箱中遮光保存，后續試驗根據需要可配制成相應濃度。

(2)菌懸液及濾紙圓片制備：每次試驗前預先對大腸埃希氏菌、傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母5種供試菌進行活化，挑取活化過的各種供試菌的單菌落，接種于裝有10 mL無菌生理鹽水及無菌玻璃珠的錐形瓶中，振蕩10 min。采用OD600 nm值法對菌懸液濁度進行調整，得到108CFU/mL的菌懸液，進行梯度稀釋后制備107CFU/mL的菌懸液，備用。

用打孔器打出直徑為6 mm的濾紙小圓片，121 ℃滅菌15 min后烘干、備用。

(3)松毛菇多酚抑菌活性測定：采用濾紙片擴散法[24]。在無菌操作臺中，將無菌濾紙圓片分別置于濃度為10，20，30 mg/mL的松毛菇粗多酚和純化多酚水溶液中浸泡10 h，將無菌培養基倒入無菌培養皿，凝固后用無菌移液管準確吸取0.2 mL的5種供試菌菌懸液于培養基平板上，用涂布棒涂布均勻，靜置10 min。用無菌鑷子夾取出經不同濃度松毛菇多酚溶液浸泡過的濾紙圓片，瀝干，均勻置于含供試菌的培養基表面，以浸有無菌生理鹽水的濾紙圓片為空白對照，每個平皿均勻放置4片濾紙，編號標記，將含細菌的培養皿置于37 ℃條件下培養24 h，含有酵母的培養皿置于28 ℃條件下培養48 h，觀察濾紙圓片周圍是否出現抑菌圈，采用十字交叉法量取抑菌圈直徑，比較不同濃度多酚溶液的抑菌效果。每組試驗平行測定3次，結果取平均值。

(4)松毛菇多酚最低抑菌濃度(MIC)的測定：參照李芬芳等[25]的方法并根據實際情況有所調整。將松毛菇粗多酚和純化多酚原液配分別制成2.5，5.0，10.0，15.0，20.0，25.0，30.0 mg/mL 7個濃度，用移液管準確吸取各濃度多酚溶液1 mL置于無菌平板內，注入50 ℃無菌培養基后充分混勻，待培養基凝固后，分別滴加5種供試菌的菌懸液各0.1 mL，用涂布棒涂布均勻，靜置10 min，對含細菌和酵母菌的培養皿進行培養。將完全無菌生長的平板所對應的松毛菇多酚濃度記為最小抑菌濃度(MIC)。每組試驗平行測定3次。

(5)松毛菇多酚最低致死濃度(MBC)測定：依次將MIC測定中未見菌生長對應的各培養皿的培養菌，各吸取0.1 mL涂布于相應平板培養基上，靜置10 min，對含細菌和酵母菌的培養皿進行培養。平板菌落總數<5的最小稀釋濃度記為最低致死濃度(MBC)。

2 結果與分析

2.1 松毛菇多酚體外抗氧化活性

2.1.1 清除·OH能力 由圖1可知，松毛菇粗多酚、純化多酚和VC的濃度越高，對·OH的清除率越大，即清除能力越強，且影響顯著。當質量濃度為0.6 mg/mL時，粗多酚、純化多酚和VC對·OH清除率均達到最大值，分別為66.44%，69.37%，68.80%，此時純化多酚的清除率最高，且高于VC。當濃度<0.3 mg/mL時，粗多酚和純化多酚對·OH的清除率均低于VC；當濃度≥0.3 mg/mL時，松毛菇純化多酚對·OH的清除率均高于VC。相同濃度下，松毛菇純化多酚對·OH的清除率均高于粗多酚。綜上，松毛菇粗提及純化多酚均具有較強的·OH清除能力，且清除能力與多酚濃度呈正相關，當濃度>0.3 mg/mL時，純化多酚的清除能力強于VC。比較相同質量濃度的粗提多酚、純化酚與VC對·OH清除率的效果可知，當純化多酚濃度達到0.2 mg/mL后，純化多酚與VC對·OH清除率的效果無顯著差異，濃度達到0.5%以上后，三者清除·OH的效果無顯著差異。

小寫字母不同表示組內差異顯著(P<0.05)，大寫字母不同表示組間差異顯著(P<0.05)

圖1 不同濃度的松毛菇多酚溶液對·OH的清除能力

Figure 1 The scavenging capacity of polyphenols fromLyophyllumCinoraseensfor ·OH

·OH幾乎能與所有生物大分子(蛋白質、脂質、核酸等)發生反應，其存在與人體衰老、癌癥等多種疾病相關，因此對人體危害極大[26]。作為一種天然多酚提取物，在一定濃度下松毛菇純化多酚對·OH的清除能力強于VC，因此可以考慮將松毛菇純化多酚作為一種外源性自由基清除劑加以利用。

小寫字母不同表示組內差異顯著(P<0.05)，大寫字母不同表示組間差異顯著(P<0.05)

小寫字母不同表示組內差異顯著(P<0.05)，大寫字母不同表示組間差異顯著(P<0.05)

圖3 不同濃度的松毛菇多酚溶液對DPPH·的清除能力

Figure 3 The scavenging capacity of polyphenols fromLyophyllumCinoraseensof different concentrations for DPPH·

2.2 松毛菇多酚抑菌活性

2.2.1 不同濃度松毛菇多酚的抑菌效果 由表1可知，3種濃度(10，20，30 mg/mL)的松毛菇粗多酚對大腸埃希氏菌無抑制作用，除革蘭氏陰性的傷寒沙門氏菌外，各濃度的粗多酚對革蘭氏陽性的金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌、釀酒酵母均有抑制作用，且抑菌圈直徑大小與多酚濃度存在明顯的劑量效應關系，即抑菌效果隨著多酚濃度的增大而增強。當粗多酚濃度為20，30 mg/mL時對傷寒沙門氏菌亦呈現抑制作用。相比松毛菇粗多酚，除對大腸埃希氏菌的抑菌效果無顯著變化外，純化多酚對其他4種供試菌的抑菌圈直徑均明顯增大。不論是粗多酚還是純化多酚，相同濃度下對釀酒酵母的抑菌圈直徑均最大，說明對釀酒酵母的抑菌效果最好，30 mg/mL時對應的抑菌圈直徑分別為(10.9±0.2)，(14.7±0.2)mm。綜上，相同濃度條件下，粗多酚及純化多酚均對釀酒酵母的抑菌作用最強，且純化多酚對同一供試菌的抑菌作用均強于粗多酚。

2.2.2 最低抑菌濃度和最低致死濃度 由表2可知，在5種供試菌中，松毛菇粗多酚對釀酒酵母和枯草芽孢桿菌的MIC最低，均為5.0 mg/mL，對大腸埃希氏菌的最高，為20.0 mg/mL。松毛菇純化多酚亦對釀酒酵母和枯草芽孢桿菌的MIC最低，均為2.5 mg/mL。粗提及純化多酚對釀酒酵母的MBC最小，分別為10.0，2.5 mg/mL，對大腸埃希氏菌的MBC最大，分別為30.0，15.0 mg/mL。純化多酚對各菌種的MIC和MBC均小于粗多酚，表明純化多酚的抑菌活性強于粗多酚。綜上表明，在5種供試菌中，松毛菇粗多酚及純化多酚對釀酒酵母的抑菌能力最強，對大腸埃希氏菌的抑菌效果最弱，且純化多酚對各供試菌的抑菌作用均強于粗多酚。

表1 松毛菇多酚對供試菌的抑菌效果

Table 1 Bacteriostatic effect of polyphenols fromLyophyllumCinoraseenson the tested bacteria(n=3) mm

供試菌 純化前 純化后 10mg/mL20mg/mL30mg/mL10mg/mL20mg/mL30mg/mL對照大腸埃希氏菌6.0±0.16.0±0.16.0±0.16.3±0.16.7±0.27.0±0.16.0傷寒沙門氏菌6.0±0.17.5±0.310.1±0.27.2±0.18.7±0.212.0±0.26.0金黃色葡萄球菌7.2±0.18.1±0.29.1±0.28.5±0.19.2±0.210.1±0.36.0枯草芽孢桿菌8.3±0.29.0±0.210.3±0.28.9±0.210.4±0.212.3±0.36.0釀酒酵母8.6±0.19.2±0.610.9±0.210.5±0.113.2±0.314.7±0.26.0

表2 松毛菇多酚的MIC和MBC

3 結論

松毛菇多酚具有良好的抗菌活性，可作為天然抗氧化劑及天然植物抗菌劑應用于食品加工與醫療保健中。后續試驗可利用現代分析方法(HPLC、紅外光譜技術等)，對松毛菇多酚化合物進行結構鑒定和組分分析，進一步明確其中抗氧化和(或)抑菌效果的主要生物活性成分，探究其作用機制，并進一步將其應用于油脂、肉制品、飲料等食品加工中，從而促進松毛菇的高值化利用。