不同品種牡丹ISSR 遺傳多樣性分析

李勇慧 于相麗 馬會(huì)萍 高凱 劉名雪

（1. 洛陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，洛陽(yáng) 471934；2. 洛陽(yáng)市農(nóng)林科學(xué)院，洛陽(yáng) 471023）

牡丹（Paeonia suffruticosa）是屬于芍藥科，芍藥屬，牡丹組的多年生落葉小灌木植物［1］。牡丹歷史悠久，牡丹可分為江南地區(qū)、中原地區(qū)、西南地區(qū)以及西北地區(qū)品種群。牡丹的觀賞價(jià)值非常高，其花朵艷麗多彩，并且在醫(yī)藥和飲食方面的價(jià)值也備受關(guān)注［2-3］。大多數(shù)牡丹種植區(qū)位于山東省荷澤市，河北省柏山市，陜西省漢中市，河南省洛陽(yáng)市和四川省。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)牡丹的種植面積大約在 30 hm2［4］。

本研究對(duì)洛陽(yáng)35 個(gè)品種的牡丹利用ISSR 進(jìn)行分析。分子標(biāo)記可以準(zhǔn)確的反映出脫氧核糖核酸分子水平的遺傳變異，分子標(biāo)記相對(duì)于生化標(biāo)記、遺傳標(biāo)記、細(xì)胞標(biāo)記這些傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)標(biāo)記來(lái)說(shuō)有很多的優(yōu)點(diǎn)，如標(biāo)記的數(shù)目多，多態(tài)性高，分布廣泛，沒(méi)有環(huán)境限制等［5-6］。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列間隔區(qū)（Inter-simple sequence repeats，ISSR）技術(shù)是以SSR的3'或 5'端處連接上1-4 個(gè)嘌呤或者嘧啶堿基之后作為引物，然后對(duì)兩側(cè)具有反向排列的一段DNA 序列PCR 擴(kuò)增，然后再通過(guò)電泳和染色后，根據(jù)是否有條帶來(lái)分析不同植物間ISSR 標(biāo)記多態(tài)性［7-9］。AFLP 和SSR 技術(shù)是常見(jiàn)的牡丹遺傳多樣性分析技術(shù)，侯小改等［10］用 AFLP 技術(shù)研究了30 個(gè)來(lái)自不同地區(qū)的牡丹品種的遺傳差異。陳杰等［11］對(duì)皖北的30 個(gè)牡丹品種的利用SSR 技術(shù)分析其遺傳多樣性。也有利用ISSR 技術(shù)對(duì)四川地區(qū)、湖南地區(qū)、西南地區(qū)［12-14］的牡丹進(jìn)行分析的報(bào)道，而未見(jiàn)對(duì)洛陽(yáng)地區(qū)不同品種牡丹進(jìn)行ISSR 遺傳多樣性分析的文章。因此，本文將利用ISSR 技術(shù)研究洛陽(yáng)地區(qū)的35 種牡丹的遺傳多樣性，本文的目的在于為牡丹的合理利用以及牡丹資源管理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 本實(shí)驗(yàn)所用的牡丹（表1）均選自洛陽(yáng)牡丹研究院，選取有代表性的35 種牡丹品種進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，根據(jù)研究需要于2018 年7-8 月進(jìn)行采摘。之后將采摘的牡丹存放于裝有干燥硅膠的密封袋中備用。

1.1.2 試劑1mol/L 的Tris-HCl（pH8.0）溶液；氯仿；異戊醇；2% CTAB 溶液；3 mol/L 的NaAC 溶液；0.5 mol/L EDTA（pH8.0）溶液；冰酒精，β-羥基乙醇；75% 乙醇溶液；GoldViewI型核酸染色劑；1×TAE緩沖液；2×Taq MasterMix 混合液；10×DNA loading buffer。

1.1.3 主要儀器 SCIENTZ-48 型高通量組織研磨器；SEDIG 型梯度PCR 儀；JA2003A 型電子天平；K5500 Plus 型超微量分光光度計(jì)；LX-200 迷你離心機(jī)；TGL-16B 臺(tái)式離心機(jī)；Eppendorf AG 型PCR儀；THZ-82A 數(shù)顯恒溫振蕩器；DYY-8C 型電泳儀；101-1AB 型電熱鼓風(fēng)干燥箱；ChampChemi 610 Plus型全自動(dòng)多色熒光及化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)。

表1 樣品及編號(hào)

1.2 方法

1.2.1 牡丹DNA 的提取 本實(shí)驗(yàn)用改良的CTAB 法提取DNA。我們將每種牡丹提取兩組DNA 選取濃度和純度較好的進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

取少量牡丹葉片放于2 mL 印管，然后放入一顆鋼珠，再將此印管放進(jìn)組織研磨機(jī)中，60s后取出，再加入1 000 μL 2%的CTAB 溶液和8 μL β-羥基乙醇；將印管放入水浴鍋中65℃水浴1 h，隔10 min 倒置一次達(dá)到混勻的目的；從水浴鍋中取出后，加入500 μL CI，搖床搖10 min；以12 000 r/min 的轉(zhuǎn)速常溫離心10 min 吸取上清液，于1.5 mL 離心管中；再加入500 μL CI 于1.5 mL 離心管中，搖床搖10 min；12 000 r/min 常溫離心10 min 吸取上清液約500 μL 于1.5 mL 離心管中；加入二倍體積的冰酒精和1/10 體積3 mol/L NaAC，低溫靜置一晚上（-18℃）；保留白色球狀物，倒去溶液；加600 μL 75%乙醇清洗兩次。

清洗后5-10 min 常溫干燥DNA，之后50℃烘干20 min 左右；加適量無(wú)菌水（50-100 μL）溶解DNA，置于冰箱中冷藏。之后通過(guò)超微量分光光度計(jì)測(cè)定DNA 的濃度與純度，過(guò)后將濃度與純度較好（濃度在50 ng/mL 左右）的DNA 放入冰箱備用。

1.2.2 引物篩選及ISSR-PCR 擴(kuò)增 任意選取6 種牡丹品種的DNA 用UBC 公布的220 種引物進(jìn)行篩選，進(jìn)行初篩和復(fù)篩，使用溫度梯度模式選擇合適的退火溫度，溫度設(shè)定為45、50、55 和59℃四個(gè)溫度梯度，最后篩選出12 條能擴(kuò)增出清晰條帶的引物，引物所用退火溫度分別為50℃和55℃（表2）。然后對(duì)牡丹樣品進(jìn)行ISSR-PCR 擴(kuò)增，PCR 采用的是15 μL 的體系，經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)后擴(kuò)增體系選定的試劑是2×Taq MasterMix 混合液（表3）。經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)確定最佳PCR 擴(kuò)增程序（表4）。

表2 引物序列

表3 PCR-ISSR 反應(yīng)體系

表4 PCR 程序設(shè)置

1.2.3 瓊脂糖凝膠電泳 PCR 之后用電泳觀察結(jié)果，制備濃度為1%的膠。配膠之后，將膠在電泳液中放置之后拿出以防加樣孔中有氣泡影響加樣。第一個(gè)加樣孔加入4 μL D2000 Ladder 與1 μL Loadingbuffer混合 液（將Ladder 與Loadingbuffer 放在手套上吹打以混勻）作為對(duì)照組，之后的加樣孔加入5 μL 的擴(kuò)增后的產(chǎn)物。電泳30-45 min（電壓為120-130 V，電流為100 mA），在電泳完成后利用凝膠成像系統(tǒng)觀察記錄結(jié)果，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 觀察電泳圖譜，將無(wú)條帶的位置記為0，有條帶記為1，在excel 表中列出0-1 矩陣。再利用POPGENE32 軟件進(jìn)行遺傳分析，使用軟件計(jì)算多態(tài)位百分率、有效等位基因、Nei’s 基因多樣性、Shannon’s 信息指數(shù)等［15］。使用NTSYSpc-2.10e 得出UPGMA 親緣關(guān)系聚類圖，通過(guò)觀察聚類圖分析牡丹品種間的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 ISSR擴(kuò)增結(jié)果及多態(tài)性分析

篩選出的12 條引物擴(kuò)增35 種牡丹皆能產(chǎn)生清晰的條帶（電泳結(jié)果圖見(jiàn)圖1-圖3）。結(jié)果擴(kuò)增出的130 條條帶中多態(tài)性的條帶有125 條，多態(tài)性占比96.1%，除97、93、91、60 和48 號(hào)引物外，其余引物的多態(tài)性全部達(dá)到100%。其中97 號(hào)引物的多態(tài)性比率為90%是最低的。而125 號(hào)引物擴(kuò)增出位點(diǎn)數(shù)最少（表5）。表明12 條引物的多態(tài)性良好，35 個(gè)牡丹品種的遺傳多樣性較豐富，利用ISSR 標(biāo)記進(jìn)行不同品種牡丹遺傳多樣性的分析是可行的。

2.2 遺傳多樣性分析

將0-1 矩陣從excel 表中導(dǎo)入到popgene32，對(duì)牡丹的多樣性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和計(jì)算分析，結(jié)果平均Nei’s 基因遺傳多樣性指數(shù)（He）為0.294 5，最大值為0.4187最小值為0.090 1，平均Shannon 信息指（H）為0.465 9，最大值為0.6095最小值為0.190 4。從上述得到的數(shù)據(jù)分析后得出35 個(gè)牡丹品種遺傳多樣性豐富，12 條引物多態(tài)性良好。

2.3 牡丹的遺傳關(guān)系聚類分析

圖1 11 號(hào)引物的ISSR 擴(kuò)增圖譜

圖2 45 號(hào)引物的ISSR 擴(kuò)增圖譜

圖3 59 號(hào)引物的ISSR 擴(kuò)增圖

表5 牡丹ISSR 標(biāo)記的多態(tài)性Penoy

由12 條引物對(duì)洛陽(yáng)35 個(gè)牡丹品種進(jìn)行ISSRPCR 擴(kuò)增獲得的130 個(gè)條帶，利用NTSYSpc-2.10e軟件計(jì)算洛陽(yáng)35 個(gè)牡丹品種間的遺傳相似系數(shù)，遺傳相似系數(shù)范圍在0.553 8-1.0000 之間，其中遺傳相似系數(shù)最小的為香玉和王紅說(shuō)明這兩個(gè)品種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。遺傳相似系數(shù)最大的是瓔珞寶珠和香玉的表示這兩個(gè)品種親緣關(guān)系較近。再根據(jù)遺傳相似系數(shù)使用NTSYSpc-2.10e 軟件得到35 種牡丹的UPGMA親緣關(guān)系聚類圖（圖4）。遺傳相似系數(shù)以0.75為界，能夠?qū)?5 個(gè)牡丹品種分為5 類，第1 類包含5 個(gè)品種可分為2 個(gè)亞類，第1 亞類中包含3 個(gè)品種，依次為鶴頂紅、文培紫和海棠爭(zhēng)潤(rùn)。第2 亞類包含2 個(gè)品種為似荷連和錦袍紅。第2 類包含1 個(gè)品種為銀粉金鱗。第3 類分為2 個(gè)亞類第1 亞類包括4 個(gè)品種依次為大正之夸、皺葉紅、迎日紅和圣代。第2 亞類包括金桂飄香、姚黃、朝陽(yáng)紅、紅梅傲雪、綠蒂隱玉、紫蘭魁、瓔珞寶珠、香玉、紅寶石和太陽(yáng)。第4 類分為2 個(gè)亞類，第1 亞類包括CH5、王紅、長(zhǎng)枝英榮、映紅、萬(wàn)花盛、玉樓點(diǎn)翠、大棕紫、景玉、花蝴蝶和蜂飛蝶舞。第2 亞類包括佛門(mén)袈裟、海黃、雪桂和白王獅子。第5 類的彩霞單獨(dú)為一亞類。

圖4 洛陽(yáng)35 種牡丹的UPGMA 親緣關(guān)系聚類圖

3 討論

ISSR 可以提供更多的基因組DNA 信息是因?yàn)槿诤狭薙SR 和RAPD 的優(yōu)點(diǎn)。因此，ISSR 在分子標(biāo)記、基因定位、親緣關(guān)系分析、遺傳多樣性、輔助育種等方面已廣泛應(yīng)用［16］。ISSR 標(biāo)記技術(shù)對(duì)于牡丹來(lái)說(shuō)具有很多優(yōu)點(diǎn)，其中包括多態(tài)性豐富、實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性強(qiáng)、試驗(yàn)穩(wěn)定性好［17-20］。因?yàn)镮SSR分子標(biāo)記技術(shù)優(yōu)點(diǎn)眾多所以本實(shí)驗(yàn)利用ISSR 對(duì)不同品種的牡丹進(jìn)行遺傳多樣性研究。用NTSYSpc-2.10e軟件得出35 個(gè)牡丹樣品間的相似系數(shù)在0.5338-1.0000 之間，其中遺傳相似系數(shù)最小的為香玉和王紅說(shuō)明這兩個(gè)品種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，遺傳相似系數(shù)最大是瓔珞寶珠和香玉的說(shuō)明這兩個(gè)品種親緣關(guān)系較近。

圖5 聚類所得5 大類牡丹代表品種圖片

以遺傳相似系數(shù)0.75 為界，能夠?qū)?5 個(gè)牡丹品種分為5 類（代表品種如圖5），第1 類包含的5個(gè)品種分成了兩個(gè)亞類，第1 亞類中包含3 個(gè)品種，依次為鶴頂紅花為淺紅色、文培紫花為紫色、海棠爭(zhēng)潤(rùn)花為粉紫紅色。第2 亞類包含2 個(gè)品種似荷連花色為粉紫色、錦袍紅花色為紫紅色。第2 類包含銀粉金鱗這一個(gè)品種花色深粉紅色。第3 類分為2個(gè)亞類第1 亞類包括4 個(gè)品種依次為大正之夸花為紫色、皺葉紅花為淺紅色、迎日紅花為紅色、圣代花為粉紅色。第2 亞類包括金桂飄香花為紫色、姚黃花為淡黃色、朝陽(yáng)紅花為粉紅色、紅梅傲雪花為粉色、綠幕隱玉花色初開(kāi)為綠色盛開(kāi)后為白色、紫蘭魁花色為粉紫色、瓔珞寶珠花為淺紅色、香玉花初開(kāi)淺粉色，盛開(kāi)潔白如玉、紅寶石花為紫紅色、太陽(yáng)花大紅色。第4 類分為兩個(gè)亞類，第1 亞類包括王紅花為紫紅色、CH5、長(zhǎng)枝英榮、映紅花為紅色、萬(wàn)花盛花為淺紅色、大棕紫花為紫紅色、玉樓點(diǎn)翠花為白色、景玉花為白色、花蝴蝶花為紅色、蜂飛蝶舞。第2 亞類包括海黃花為黃色、佛門(mén)袈裟花為紅色、白王獅子花為白色、雪桂花為白色。第5 類的彩霞單獨(dú)為一亞類，花色為淺紅色。由此可見(jiàn)，35 種牡丹并不一定按照花色進(jìn)行分類，只有親緣關(guān)系較近時(shí)才會(huì)聚在一起。這一結(jié)果與安宗燕等［21］對(duì)紫斑牡丹品種的EST-SSR 遺傳多樣性分析的結(jié)果一致。也與陳向明等［22］用RAPD 技術(shù)對(duì)19 個(gè)日本牡丹品種進(jìn)行親緣關(guān)系分析的結(jié)果一致。從研究后得出的結(jié)論和結(jié)果來(lái)看，ISSR 技術(shù)是研究牡丹品種分類的理想工具之一。

4 結(jié)論

由于牡丹非常名貴，牡丹的種質(zhì)資源研究一直被人們所關(guān)注。因此牡丹的遺傳多樣性分析對(duì)于牡丹的種質(zhì)資源管理是非常必要的。本研究采用改良的CTAB 法以及PCR 擴(kuò)增從220 條引物中篩選出12 條引物，多態(tài)性條帶的占比為96.1%。用popgene32 分析得出35 種牡丹的平均Shannon 信息指數(shù)H=0.465 9，平均Nei's 基因多樣性指數(shù)He= 0.294 5，說(shuō)明35 個(gè)牡丹品種遺傳多樣性豐富。利用NTSYS2.10e 分析最后將35 種牡丹分為5 類。實(shí)驗(yàn)中的35 種牡丹并不一定按照花色進(jìn)行分類，只有在親緣關(guān)系較近時(shí)才會(huì)聚在一起。