閃式輔助超聲提取長白落葉松中二氫槲皮素的工藝研究

霍云博，王露瑤，劉怡辰，呂 萍

(吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院食品工程學(xué)院，吉林 吉林 132101)

長白落葉松(LarixolgensisHenry、KoreanLarch)別名黃花落葉松、黃花松、朝鮮落葉松長白。從長白落葉松中提取出的二氫槲皮素又叫花旗松素、紫杉葉素、雙氫櫟精。二氫槲皮素是藥用植物中重要的二氫黃酮醇類化合物，屬于維生素PP族[1]。研究表明，二氫槲皮素具有抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、抗心血管系統(tǒng)疾病等生物活性，在醫(yī)藥、食品、保健產(chǎn)品、煙草等行業(yè)有著廣泛的應(yīng)用[1]。

閃式提取法是一種新型的提取方法，它利用植物組織破碎原理，使有效成分能夠從植物體內(nèi)大量溶解，快速、簡便、無須加熱，可以節(jié)省大量的時(shí)間、精力和能源， 能夠在數(shù)秒鐘內(nèi)完成提取過程。本實(shí)驗(yàn)將閃式提取和超聲提取相結(jié)合，極有可能達(dá)到節(jié)能、高效、時(shí)間短和高提取率的效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

長白落葉松松針采摘于吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院校園內(nèi)，置于電熱恒溫干燥箱80℃常壓干燥至恒重，粉碎至80目篩，裝入磨口玻璃瓶備用。

實(shí)驗(yàn)試劑：二氫槲皮素標(biāo)品(實(shí)驗(yàn)室自制)；硫酸、乙醇、乙酸、甲醇、蒸餾水(自制)、氫氧化鈉、無水乙醇、石油醚、乙醚、氯仿，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

實(shí)驗(yàn)儀器：恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司生產(chǎn))；500 g多功能粉碎機(jī)XS-10(上海兆申科技有限公司生產(chǎn))；數(shù)控超聲波清洗器KQ3200DB(昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn))；紫外可見分光光度計(jì)UV-2800AH(尤尼柯上海儀器有限公司生產(chǎn))或V-1100D可見分光光度計(jì) (上海美譜達(dá)儀器有限公司生產(chǎn))；YRE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器或旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52A(上海亞榮盛華儀器廠生產(chǎn))等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)二氫槲皮素50 mg溶于乙醇中，定容100 mL，制備成0.5 mg/mL的對照液。取對照液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL移入25 mL容量瓶中，加入乙醇，使乙醇的體積達(dá)到3 mL/25 mL，加水定容。于300 nm處測定其吸光度[2]，用吸光度Y對二氫槲皮素濃度X(mg/mL)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 二氫槲皮素提取及精制

提取工藝： 長白落葉松松針→干燥→粉碎→稱取松針粉末50 g→加入提取劑→閃式提取→收集提取液→超聲波處理→收集上清液→抽濾→減壓干燥→二氫槲皮素粗品→精制→高純度二氫槲皮素。

精制流程：二氫槲皮素粗品→熱水溶解殘?jiān)淅鋬鼋Y(jié)晶→快速離心→干燥

將減壓濃縮至干的二氫槲皮素粗品，用熱水溶解殘?jiān)淅鋬?5℃)結(jié)晶后快速離心，分離得到二氫槲皮素[3，4]。

計(jì)算：二氫槲皮素得率(mg/g)=aV/m×100%

式中：

a，提取液中二氫槲皮素濃度(mg/mL)；V，提取液的體積(mL)；m，樣品質(zhì)量(g)。

1.3.3 二氫槲皮素的定性檢驗(yàn)

三氯化鋁顯色法：取上清液和對照液各2 mL于25 mL容量瓶中，加入1.0 mL 1%的三氯化鋁-乙醇溶液，然后加入乙醇，使乙醇的總體積達(dá)到3 mL/25 mL，加水定容至25 mL，在波長200～600 nm范圍進(jìn)行全波長掃描，兩者在300 nm處均有較強(qiáng)的吸收，其紫外可見光譜如圖1所示。

圖1 二氫槲皮素和樣品與三氯化鋁絡(luò)合后的紫外可見光譜圖Fig.1 UV-visible spectrum of complexed dihydroquercetin and sample with aluminum trichloride

1.3.4 提取劑的選擇

將長白落葉松、松樹、松枝粉末準(zhǔn)確稱取3份，每份5 g。將3份樣品分別放入三角瓶中，并分別加入20 mL乙醇、乙酸和蒸餾水進(jìn)行閃式提取后合并提取液，再進(jìn)行超聲波提取合并提取液的上清液。將提取液進(jìn)行抽濾干燥，算出提取率，選用提取率最高的溶劑作為提取劑。通過單因素實(shí)驗(yàn)得出，最佳提取劑選擇為乙醇。

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上， 利用Box-Behnken對實(shí)驗(yàn)因素和水平進(jìn)行設(shè)計(jì)，采用軟件Design Expert 8.0.6進(jìn)行設(shè)計(jì)。最終根據(jù)響應(yīng)曲面法來確定各相關(guān)因素之間的交互作用及影響長白落葉松松針中二氫槲皮素提取率的程度，篩選出優(yōu)化工藝的條件[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 長白落葉松松針中二氫槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

從計(jì)算結(jié)果來看, 二氫槲皮素濃度與吸光度線性關(guān)系R2為0.999 9，線性關(guān)系良好，回歸方程為y=51.786x-0.013，詳見圖2。

圖2 二氫槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of dihydroquercetin

2.2 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行4因素3水平響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，如表1所示， 數(shù)據(jù)方差分析結(jié)果如表2所示。

表1 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab.1 Experimental design of response surface method

2.2.2 響應(yīng)面數(shù)學(xué)模型建立及其顯著性檢驗(yàn)

經(jīng)過Design expert 8.0.6軟件的計(jì)算和表2的結(jié)果可知，回歸模型結(jié)果極其顯著 (P<0.01)，建立的模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，回歸方程為：

表2 回歸方程的方差分析Tab.2 ANOVA of regression equations

注：**代表極顯著(P<0.01)、*代表顯著(P<0.05)。

2.2.3 優(yōu)化條件的模型驗(yàn)證

利用Design expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)分析得出長白落葉松中二氫槲皮素最佳超聲提取工藝條件，得到回歸方程。考慮到實(shí)際操作的便利性以及更可靠的驗(yàn)證模型預(yù)測準(zhǔn)確性，將條件設(shè)定為：閃式提取時(shí)間120 s、超聲波功率190 w、液料比1∶10、超聲提取時(shí)間32 min，并再次進(jìn)行了相關(guān)驗(yàn)證，得到的實(shí)際平均二氫槲皮素提取率與之前計(jì)算的預(yù)測值間的相對偏差也是較為微小的，可以證明模型預(yù)測值與實(shí)際結(jié)果基本符合。

3 結(jié)論與討論

傳統(tǒng)的方法(回流法、浸漬法、微波萃取法等)操作簡單，但提取時(shí)間較長，有時(shí)長達(dá)數(shù)周或者提取率較低。本研究方法采用閃式輔助超聲提取法提取長白落葉松中二氫槲皮素，可加快提取速度，縮短提取時(shí)間，提高提取率。本研究利用響應(yīng)面法優(yōu)化長白落葉松中二氫槲皮素閃式輔助超聲提取工藝參數(shù)，以長白落葉松中二氫槲皮素提取率為響應(yīng)值，作為連續(xù)變量，應(yīng)用軟件Design Expert 8.0.6進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)， 綜合考慮提取溫度、料液比、提取時(shí)間及其相互作用對二氫槲皮素提取率的影響，利用軟件對數(shù)據(jù)擬合得二氫槲皮素提取回歸方程，并對提取溫度、料液比、提取時(shí)間進(jìn)行方差分析，并利用該軟件優(yōu)化提取工藝參數(shù)，確定最佳提取劑為乙醇。結(jié)果表明，對二氫槲皮素提取率的影響因素大小順序?yàn)橐毫媳?超聲提取時(shí)間>閃式提取時(shí)間>超聲波功率，最佳提取工藝參數(shù)為閃式提取時(shí)間120 s、超聲波功率190 w、液料比1∶10、超聲提取時(shí)間32 min。在此條件下，二氫槲皮素提取率最高為0.48%。