紅景天苷調控GSK-3β對腦缺血/再灌注大鼠的神經保護作用

邱 麒，黃 鑫，唐宇恒，劉俊杰，孫春曉，許阿娟，賴文芳，洪桂祝

(1. 福建衛生職業技術學院藥學系，福建 福州 350101； 2. 福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122)

腦卒中是嚴重威脅人類健康的常見病，同冠心病、癌癥并列為威脅人類健康的三大疾病之一，其中缺血性腦卒中約占87%，嚴重威脅著卒中患者的生命健康和生活質量[1]。紅景天(RhodioldroseaL.)屬于薔薇目景天科，是中國傳統醫藥學中的重要草藥，具有改善心血管功能，保護肝臟，抗衰老，以及神經保護等多種藥理作用[2]。紅景天苷(salidroside，Sal)是從紅景天中提取出來的苯乙醇類化合物，是紅景天主要有效成分。課題組前期研究發現，紅景天苷能夠降低腦梗死體積，改善神經功能損傷，降低C3補體成分，促進Egrs家族蛋白表達，調控Bcl-xl/Bax蛋白，減少神經凋亡[3-7]。而糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)是一種在進化上非常保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，能作用于眾多信號蛋白結構蛋白和轉錄因子，調節細胞的分化、增殖、存活和凋亡，目前越來越多的研究者選擇其作為癌癥、神經退行性疾病，神經精神類疾病等多種重大疾病的治療靶點[8-9]。本研究以GSK-3β為治療靶點，進一步探討紅景天苷腦保護的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物SPF級健康♂SD大鼠86只，體質量 (260～280) g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，合格證號：2015000510392，許可證號：SCXK(滬)2017-0005，由福建中醫藥大學實驗動物中心飼養，許可證號：SYXK(閩)2014-0005。

1.2 藥品與試劑紅景天苷(福建中醫藥大學，純度≥98%，批號：20160928)；線栓(廣州佳靈技術有限公司)；RIPA(碧云天生物技術有限公司)，PMSF(碧云天生物技術有限公司)，BCA蛋白濃度測定試劑盒，均來自碧云天生物技術有限公司。蛋白上樣緩沖液(生工生物工程上海有限公司)；鼠抗β-actin(北京全式金公司)；caspase-9，cleaved caspase-9，GSK-3β，NMDAR1，GluR2(Cell Signaling Technology 公司)，pGSK-3β(Santa Cruz Biotechnology公司)。

1.3 儀器Infinite M20 Pro多功能酶標儀(瑞士TECAN公司)，小型垂直電泳槽，小型轉印槽(Bio-Rad)，基礎電泳儀電源(Bio-Rad)，凝膠成像分析系統(Bio-Rad,型號：ChemiDocXRS+)，高速臺式冷凍離心機(Thermo Fisher，型號：PrimoR)。

1.4 藥品配制紅景天苷注射液：稱取紅景天苷粉末1.5 g溶入0.2 L 0.9%生理鹽水中，充分溶解至澄清，4 ℃保存待用。

2 方法

2.1 動物分組和給藥第一批：SD大鼠造模成功后隨機分為假手術組(Sham)12 只、模型組(MCAO)12 只、紅景天苷給藥組(MCAO+Sal)12 只。造模2 h，再灌注1 h后，MCAO+Sal組腹腔注射紅景天苷(50 mg·kg-1·d-1)，其余組注射0.9%生理鹽水(10 mL·kg-1·d-1)，給藥1 d后取材。

第二批：SD大鼠隨機分為6組，即人工腦脊液+Sham組(Sham)、GSK-3β抑制劑+Sham組(SB216763+Sham)、人工腦脊液+MCAO組(MCAO)、GSK-3β抑制劑+MCAO組(SB216763+MCAO)，人工腦脊液+MCAO+Sal組(MCAO+Sal)，GSK-3β抑制劑+MCAO+Sal組(SB216763+MCAO+Sal)，每組各10 只。經側腦室注射GSK-3β抑制劑SB216763或人工腦脊液30分鐘后，除假手術組外，其余組進行MCAO造模，造模后MCAO+Sal和SB216763+MCAO+Sal組腹腔注射紅景天苷(50 mg·kg-1·d-1)，其余組注射0.9%生理鹽水(10 mL·kg-1·d-1)，給藥1 d后取材。

2.2 MCAO模型制作大鼠經2%戊巴比妥鈉(2 mL·kg-1)腹腔注射麻醉后，仰臥位固定，除去頸部的毛并用碘伏擦拭頸部皮膚消毒后，剪開頸部皮膚，鈍性分離皮下組織，分離左側頸總動脈(CCA)，頸外動脈(ECA)、頸內動脈(ICA)，結扎 CCA、ECA。動脈夾夾閉 ICA，使用眼科剪呈45°在CCA近心端血管壁上剪一小口，插入線栓至大腦中動脈起始端。2 h后再次麻醉大鼠，將線栓抽出并結扎開口，實現再灌注，假手術組不進行插線栓操作。參考Zea-Longa的5級4分法[10]進行神經功能評分，評分 ≥2 分的實驗動物為模型制作成功，用于后續實驗。

2.3 Western blot 檢測cleaved caspase-9、GSK-3β、NMDAR1、GluR2的表達取新鮮大鼠左腦組織，用剪刀把組織剪切成細小碎片。稱取100 mg加入1 mL蛋白裂解液(含有1%PMSF+1%蛋白磷酸酶抑制劑)進行勻漿，再4 ℃離心10 min后小心吸取上清至干凈的管中，即得總蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度。

蛋白采用SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉法將分離蛋白轉至預先活化好的PVDF膜上，麗春紅染色觀察膜上是否有清晰條帶，再用5% BSA封閉 2 h后孵育一抗4 ℃過夜，一抗根據抗體說明書稀釋比例制備，caspase-9(1 ∶1 000)、GSK-3β(1 ∶1 000)、NMDAR1(1 ∶1 000)、GluR2(1 ∶1 000)。次日搖床室溫孵育二抗2 h，PVDF膜用TBST洗滌(10 min×3)之后加ECL顯色劑，采用凝膠成像系統檢測，以β-actin為內參，分析目的條帶/β-actin的相對表達量。

3 結果

3.1 紅景天苷對MCAO大鼠缺血側腦組織cleaved caspase-9蛋白表達的影響MCAO模型大鼠給藥1 d，與Sham組比較，MCAO模型大鼠缺血側cleaved caspase-9蛋白表達增加。經紅景天苷干預后，cleaved caspase-9蛋白表達降低，且具有統計學差異(P<0.01)(Fig 1)。

3.2 紅景天苷對MCAO大鼠缺血側腦組織pGSK-3β、NMDAR1、GluR2蛋白表達的影響與Sham組比較，MCAO模型大鼠缺血側pGSK-3β、NMDAR1、GluR2的蛋白表達量顯著降低。經紅景天苷作用后，顯著促進pGSK-3β、NMDAR1、GluR2蛋白表達，具有統計學差異(P<0.01)(Fig 2)。

3.3 側腦室注射GSK-3β抑制劑和腹腔注射紅景天苷對MCAO大鼠缺血側腦組織中cleaved caspase-9蛋白表達的影響側腦室注射GSK-3β抑制劑和腹腔注射紅景天苷后，與MCAO組比較，MCAO+Sal組可明顯降低MCAO模型大鼠缺血側腦組織中cleaved caspase-9的蛋白表達，具有統計學差異(P<0.05)；而側腦室注射SB216763后cleaved caspase-9蛋白表達無變化(Fig 3)。

Fig 1 Effects of salidroside treatment on cleaved caspase-9 protein in MCAO ##P<0. 01 vs Sham，**P<0. 01 vs MCAO

Fig 2 Effects of salidroside treatment on pGSK-3β, NMDAR1, GluR2 protein in MCAO n=6)##P<0. 01 vs Sham, **P<0. 01 vs MCAO

Fig 3 Effects of salidroside or SB216763 treatment on caspase-9 protein in MCAO ##P<0.01 vs Sham,**P<0.01 vs MCAO, △P<0.05 vs SB216763+Sham,▲▲P<0.01 vs MCAO+Sal

3.4 側腦室注射GSK-3β抑制劑和腹腔注射紅景天苷對MCAO大鼠缺血側腦組織中pGSK-3β、NMDAR1、GluR2蛋白表達的影響側腦室注射GSK-3β抑制劑和腹腔注射紅景天苷后，與MCAO組比較，MCAO+Sal組可明顯降低MCAO模型大鼠缺血側腦組織中pGSK-3β、NMDAR1、GluR2蛋白表達，差異有統計學意義(P<0.05)；而側腦室注射SB216763后pGSK-3β、NMDAR1、GluR2表達均無變化(Fig 4)。

4 討論

目前，神經元凋亡被認為是腦缺血損傷后繼發性損害的重要機制，GSK-3β作為一種多功能的絲氨酸/蘇氨酸激酶，其活性主要由膚鏈中所含絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)的磷酸化水平決定，Tyr216磷酸化后GSK3β活性增強而Ser9的磷酸化則抑制GSK3β活性。在腦缺血/再灌注時，活化后的GSK可以誘導細胞凋亡，并調節線粒體mPTP開放程度，進而影響細胞色素C( Cyt-c)釋放，caspase-9發生自我催化，活化的caspase-9 進一步誘導caspase-3進行切割并使之激活，使級聯反應進一步放大，被激活的caspase-3通過對caspase靶蛋白的水解，進一步加重凋亡損傷[11-12]。本研究結果發現caspase-9前體被大量激活，cleaved caspase-9增多，經紅景天苷干預后，翻轉該結果，提示紅景天苷能抑制神經細胞的線粒體依賴途徑凋亡。同時，實驗中發現紅景天苷給藥組的神經功能損傷明顯低于模型組，且GSK-3β磷酸化水平升高，表明紅景天苷可以促進GSK-3β磷酸化，抑制其活性。

Fig 4 Effects of salidroside or SB216763 treatment on pGSK-3β,NMDAR1, GluR2 protein in MCAO n=6)##P<0.01 vs Sham, **P<0.01 vs MCAO, △P<0.05 vs SB216763+Sham,▲▲P<0.01 vs MCAO+Sal

有研究表明，紅景天苷可以抑制鈉通道從而抑制突觸的Glu釋放和交感神經傳遞而發揮神經保護作用，減輕腦缺血/再灌注損傷[13]。在海馬組織絕大部分神經元突觸表面的受體含有G1uR2亞基，腦缺血繼發性損傷刺激可使GluR2表達下降，導致鈣離子通過AMPA受體離子通道內流增加，加重神經元損傷[14]。同時NMDA1受體(N-methyl-D-aspartate receptor)是中樞神經系統內一類重要的興奮性氨基酸，能夠參與腦缺血病理狀態下的興奮毒性機制，位于突觸外的NMDAR過度激活會導致興奮性毒性，位于突觸內的NMDAR激活可以促進細胞存活。本研究表明，經紅景天苷干預后，能夠增加大鼠腦缺血側腦組織中NMDA1和GluR2的蛋白表達，減少神經細胞凋亡。Patrick等[15]研究表明NMDA1受體和GluR2的分布與表達是治療腦缺血和心肌缺血的重要機制。但是關于其上游調控機制鮮有報道。而PI3K/Akt信號通路是最主要的神經細胞存活信號通路，Akt可促使GSK-3β磷酸化增多，抑制其活性從而調節神經細胞凋亡屢有報道。為了證實紅景天苷對caspase-9、NMDA1和GluR2的調節作用是通過影響GSK-3β的活性發揮作用，我們使用GSK-3β抑制劑，結果發現，注射SB216763后再給予紅景天苷治療，結果顯示以上蛋白無變化。提示紅景天苷是通過促進GSK-3β的磷酸化，降低caspase-9、NMDA1和GluR2的表達，減少細胞凋亡，從而發揮腦保護作用。為探究紅景天苷抗細胞凋亡的腦保護作用研究奠定基礎。

(本實驗在福建中醫藥大學藥學院生物醫藥研發中心及省級中藥學重點實驗室完成，感謝所有老師及同學們的支持與幫助！)