類葉升麻苷延緩SAMP8小鼠衰老過程及改善免疫功能的作用

陳嘉媛，高 莉，譚 雪，王冬青，閆 明

(1. 石河子大學藥學院，新疆 石河子 832003， 2. 新疆維吾爾自治區維吾爾醫藥研究所，新疆維吾爾醫方劑學重點實驗室,新疆 烏魯木齊 830011)

阿爾茨海默病(alzheimer′s disease，AD)在臨床主要表現為漸進性認知衰退及癡呆，其病理特點是淀粉樣斑塊和神經纖維纏結，神經元細胞丟失，膠質細胞的顯著激活，以及全身免疫反應。AD全身免疫反應的改變包括淋巴細胞和巨噬細胞分布和激活的變化、自身抗體的存在或異常細胞因子的產生[1]。病理學、遺傳學和流行病學研究均支持免疫機制參與AD發病機制的觀點[2]。另外，先天免疫細胞，特別是小膠質細胞和星形膠質細胞介導AD神經炎癥的能力，也被認為是疾病發病的重要因素[3-4]。

類葉升麻苷(acteoside，AE)是苯乙醇苷類中一種天然活性成分，具有抗氧化損傷、神經保護、肝臟保護、免疫調節等多種作用。前期研究顯示，類葉升麻苷有改善AD小鼠老化和抑制免疫器官萎縮的作用[5-6]，但其對于免疫功能方面的作用機制仍不清楚。本實驗旨在深入研究類葉升麻苷對小鼠老化及免疫細胞和免疫炎癥因子的影響，探討其對老齡小鼠免疫功能的影響。

1 材料及方法

1.1 藥物與試劑類葉升麻苷(為新疆維吾爾自治區維吾爾醫藥研究所自制，純度≥98%，20170827 ),鹽酸美金剛片(丹麥靈北藥廠，694478)，75%消毒酒精(新疆愛迪爾生物科技有限公司，20171225)，0.9%氯化鈉注射液(四川科倫藥業股份有限公司，L217010304),FITC偶聯小鼠CD4抗體、APC偶聯抗小鼠的抗原CD3e抗體、PE-CY7偶聯小鼠CD8抗體、Mouse Th1/Th2/Th17 CBA Kit(BD BIOSCIENCES PHARMINGEN，7276920、7150784、7215735、7076519)

1.2 實驗儀器SQP電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司，北京)，恒溫生化培養箱(博訊實業有限公司醫療設備廠，上海)，LDZM-80KCS-Ⅱ型立式壓力蒸汽滅菌鍋(申安醫療器械廠，上海)，Allegra 64R 離心機(Beckman)，FC500流式細胞儀(Beckman)，4 ℃冰箱(海爾股份有限公司，青島)，-20 ℃冰箱(海爾股份有限公司，青島)，-80 ℃冰箱(Thermo)。

1.3 實驗動物實驗鼠使用健康SAMP8小鼠，以同月齡SAMR1小鼠為對照，♂，體質量(20±2)g。購于天津中醫藥大學第一附屬醫院(合格證號SCXK(津)2015-0003)。飼養于新疆維吾爾自治區維吾爾醫藥研究所SPF級動物房(動物使用許可證號2018-0001)，溫度(21～25) ℃，濕度24%～52%，12 h明暗交替飼養，自由攝食飲水。

1.4 分組及給藥根據體質量及老化評分結果篩選出12只對照SAMR1小鼠和60只符合要求的SAMP8鼠，SAMP8隨機分為5組，每組12只，每天灌胃給藥1次，連續90 d，給藥劑量如下：(1)正常對照組：(SAMR1小鼠)，0.1 mL·10 g-1· d-1生理鹽水灌胃。(2)模型組：0.1 mL·10 g-1· d-1生理鹽水灌胃。(3)美金剛組：10 mg·kg-1· d-1灌胃。(4)類葉升麻苷-低：30mg·kg-1· d-1灌胃。(5)類葉升麻苷-中：60 mg·kg-1· d-1灌胃。(6)類葉升麻苷-高：120 mg·kg-1· d-1灌胃。

1.5 老化評分本研究評定SAM-P 和SAM-R 小鼠的衰老等級方法，參照日本京都大學著名的竹田俊男和細川昌則教授制定的小鼠老化度評分標準[7]，根據老鼠的行為和外觀，觀察了11種評分項的發生情況，包括：反應性、被動性逃避反應、皮膚光澤、皮膚粗糙度、皮膚潰瘍、眼部損傷、角膜潰瘍，渾濁、白內障和脊柱后凸等。每項指標劃分成3～5 級， 根據統一的評分標準評分，老化度越高體現在獲得的積分更多。

1.6 免疫細胞檢測在 3 μL CD3、CD4和CD8中分別加入抗凝全血100 μL，充分震蕩混勻，于室溫避光反應15 min。取裂紅素2 mL加入并混勻后，再次避光反應15 min。反應后離心5 min，轉速1 000 r·min-1，棄上清。1 mL PBS，1 000 r·min-1離心5 min。200 μL PBS重懸，200目過濾。經流式細胞儀檢測，Kaluza Analysis分析處理。

1.7 免疫因子檢測標準品制備：取2 mL Assay Diluent 稀釋標準品，在避免劇烈渦旋下保證混勻，混勻后靜置15 min，再用Assay Diluent倍比稀釋最高濃度標準品，取每種捕獲微球懸液混合，取標準品或樣品每管50 μL，再依次加入50 μL捕獲微球混合液及50 μL PE檢測抗體孵育，孵育后以1 mL 洗滌緩沖液洗滌、離心，棄上清。為重懸微球每管加入300 μL 洗滌緩沖液,并過200目篩。上機獲取樣品，使用FCAP軟件導出和分析FCS數據文件。

2 結果

2.1 類葉升麻苷對老化評分的影響本實驗中老化評分分別于給藥前，給藥后45 d、90 d進行。給藥前，與對照組相比，SAMP8小鼠老化評分顯著增高；給藥45 d，與對照組相比，模型組老化評分顯著增高，與模型組比，美金剛組及類葉升麻苷中、高劑量組小鼠老化評分顯著降低；給藥90 d，與對照組比，模型組老化評分高于正常組，且有顯著性差異，與模型組相比，美金剛組及類葉升麻苷低、中、高劑量組小鼠老化評分存在顯著降低趨勢(見Fig 1)。

Fig 1 Effect of AE on aging score of SAMP8 mice n=12)**P<0.01 vs control group; #P<0.05, ##P<0.01 vs model group

2.2 類葉升麻苷對小鼠免疫細胞分布的影響如Fig 2如示，與正常組相比，模型組SAMP8小鼠血漿中CD4+/CD8+顯著低于正常組R1鼠，各給藥組血漿中CD4+/CD8+均低于正常組，與模型組相比，美金剛組血漿中CD4+/CD8+顯著增高；與正常組相比，模型組SAMP8小鼠脾臟中CD4+/CD8+顯著低于正常組R1鼠，類葉升麻苷低、中劑量組小鼠脾臟中CD4+/CD8+也顯著低于正常組，類葉升麻苷高劑量組則顯著高于正常組及模型組。

Fig 2 Effect of AE on T cell subsets in peripheral blood and spleen of SAMP8 model n=12)*P<0.05, **P<0.01 vs control group; #P<0.05, ##P<0.01 vs model group

2.3 類葉升麻苷對小鼠免疫細胞因子的影響流式細胞儀檢測各組小鼠血漿及脾臟中Th1型IFN-γ及Th2型IL-4免疫因子表達差異，結果顯示：與正常組相比，模型組小鼠血漿及脾臟中IFN-γ的表達水平均顯著性降低；與模型組相比，類葉升麻苷低、高劑量組小鼠脾臟中IFN-γ的表達水平變化明顯，低劑量升高而高劑量降低。模型組小鼠血漿中IFN-γ、IL-4均顯著性降低，與模型組相比，類葉升麻苷低、高劑量組小鼠血漿中IL-4降低，有顯著性差異，類葉升麻苷高劑量組小鼠脾臟IFN-γ、IL-4降低，表現出顯著性差異；與正常組相比，模型組小鼠脾臟Th1/Th2的偏移顯著性降低，與模型組相比，類葉升麻苷低劑量組在脾臟中Th1/Th2升高，表現出顯著性差異。見Fig 3,4。

Tab 1 Effect of Cimicifugatin on Th1-type factor in plasma and spleen of SAMP8 mice n=12)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

3 討論

免疫功能在阿爾茨海默病發病機制中的作用日益受到重視。除中樞免疫反應外，外周免疫反應還包括淋巴細胞功能與亞群分布的變化[10]。人體存在T細胞、B細胞兩種免疫細胞。其中細胞免疫由T細胞負責。CD4+是輔助T細胞的一種標記。CD8+則是抑制性T細胞的一種標記。CD4+/CD8+的比值的正常，能保證機體維持正常的免疫功能狀態，該值降低是機體免疫功能下降的重要標志[8-9]。

實驗結果顯示，SAMP8模型鼠較R1鼠CD4+/CD8+顯著降低，SAMP8模型鼠是散發性阿爾茨海默病的經典動物模型[7]，有研究表明，SAMP8小鼠神經內分泌免疫調節失衡[11]。說明了SAMP8鼠免疫活性普遍下降。這為研究類葉升麻苷對 SAMP8小鼠機體免疫功能的影響提供了有力背景。 AE高劑量組能顯著提升脾臟中CD4+/CD8+的比值。提示陽性藥物美金剛則相較模型組各數值均有顯著的良性變化，類葉升麻苷能夠促進SAMP8小鼠體內輔助性淋巴細胞的增加，有效抑制殺傷性淋巴細胞的增多，從而改善機體的免疫功能，以達到阿爾茲海默病的控制與治療作用。

此外，已有大量文獻證明細胞因子在AD的促炎和抗炎過程以及復雜的認知過程中起著關鍵作用[12]。機體維持正常的內環境有賴于細胞因子的動態平衡狀態，其狀態平衡又有賴于Th1、Th2型細胞特征因子間的相互作用和抑制，若Th1型和Th2型細胞因子失衡，機體就會處于失衡的漂移狀態。Th1/Th2型偏移中Th2型細胞因子分泌較多，提示了機體免疫功能的下降，細胞因子的這種不平衡狀態與認知能力下降和癡呆癥有關。在本實驗研究中，細胞因子的分泌是SAMP8小鼠認知障礙的潛在機制之一，許多研究報告稱，衰老導致Th1和Th2細胞數量變化，Th1/Th2值失去穩態平衡[13-14]， IFN-γ和IL-4作為Th1、Th2的特征細胞因子，二者之間相互拮抗又相互促進。

Fig 3 Representative flow cytometry of CD3+ CD4+ T cell expression in peripheral blood of each group n=12)*P<0.05, **P<0.01 vs control group; #P<0.05, ##P<0.01 vs model group

Fig 4 Representative flow cytometry of CD3+ CD4+ T cell expression in spleen of each group n=12)*P<0.05, **P<0.01 vs control group; #P<0.05, ##P<0.01 vs model group

Fig 5 Effect of AE on Th1/Th2 change of *P<0.05, **P<0.01 vs control group; #P<0.05, ##P<0.01 vs model group

由實驗結果可見，與正常組相比，在血漿及脾臟中，各組的IFN-γ及IL-4都呈明顯降低趨勢，且模型組中Th1/Th2顯著偏移，提示模型鼠免疫功能的顯著下降，與美金剛組藥物相比，二者在延緩衰老的進程中沒有明顯差異，但在Th1/Th2的調節及脾臟中免疫細胞的分布上，類葉升麻苷表現出明顯優勢，AE低、中劑量組能夠上調免疫應答模式恢復Th2/Th1的平衡穩態，使細胞免疫功能增強，達到延緩動物機體衰老的作用。提示類葉升麻苷的作用機制可能與免疫平衡相關。同時，類葉升麻苷恢復細胞因子動態平衡穩態作用以脾臟表現更為顯著，這與本實驗中類葉升麻苷調節免疫細胞的分布以及對模型小鼠老化程度的改善作用均一致，進一步表明了類葉升麻苷能夠延緩快速老化小鼠老化進程，可能的作用機制是通過調節機體內免疫細胞及免疫因子的動態平衡、改善機體的免疫功能。這為后續的實驗研究提供了一定依據，類葉升麻苷明確的作用機制有待于進一步的深入研究。