白藜蘆醇對AA大鼠關節(jié)成纖維樣滑膜細胞凋亡誘導作用及可能機制

宋先兵，黃焱平，方安寧，楊 珺，周文翰，王家昊，瞿子庭，朱浩辰，李 娜，陳曉宇

(1.安徽醫(yī)學高等專科學校人體解剖教研室，合肥 230061；安徽醫(yī)科大學2. 臨床醫(yī)學院、3. 形態(tài)學實驗中心,合肥 230032)

類風濕性關節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)為慢性關節(jié)滑膜炎癥，其中成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS)增生，破壞局部關節(jié)結構，是RA形成的關鍵因素之一[1]。同時，關節(jié)疼痛、活動受限和長期治療等使RA患者機體呈應激狀態(tài)，表現(xiàn)為氧自由基(oxygen free radical，ROS)的增加[2-3]。同時，機體細胞中90%以上的ROS由線粒體產生，而且慢性長期ROS的增加可能會誘導細胞突變和致瘤性,前期研究表明，ROS的增加與FLS的異常增殖關系密切[4]。藥理學研究中，常用弗氏完全佐劑(Freund’s complete adjuvant，F(xiàn)CA)誘導佐劑性關節(jié)炎(adjuvant arthritis，AA)，作為篩選RA藥物模型[5]。

多元酚類化合物白藜蘆醇(resveratrol，Res)是從虎杖、葡萄等中提取的植物抗毒素，有抗氧化、抗炎和免疫調節(jié)作用[6]，對腫瘤細胞有一定的抗增殖特性[7]。研究證實，RA患者機體處于氧化應激狀態(tài)[2,3]；去乙酰化酶3(sirtuins 3, SIRT3)是位于線粒體中的去乙酰化酶，能夠抗氧化應激[8]；金屬抗氧化酶錳超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase，MnSOD)在線粒體中能夠將超氧陰離子自由基降解，能夠抗氧化損傷[9]。本研究探討AA大鼠模型機體的氧化應激狀態(tài)和滑膜組織中SIRT3-MnSOD蛋白表達情況，進一步應用過氧化氫(H2O2)處理培養(yǎng)AA-FLS，體外探討H2O2對FLS細胞增殖的影響， Res對低濃度H2O2(5 μmol·L-1)處理AA-FLS增殖和凋亡作用，以及AA-FLS線粒體SIRT3-MnSOD蛋白表達情況，旨在探討Res的抗氧化應激作用是否通過線粒體SIRT3-MnSOD途徑實現(xiàn)，為Res作用RA提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料白藜蘆醇(純度≥99.9%，編號501-36-1)、弗氏完全佐劑(編號 5881)購于美國Sigma公司； 30% H2O2購于北京萬佳科技有限公司；培養(yǎng)基RPMI 1640、胎牛血清(FBS)購于美國Gibco公司；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所；SIRT3(編號ab13533)、MnSOD(編號ab137037)、β-actin(編號ab8227)、波形蛋白(Vimentin)(編號ab92547)購于英國Abcam公司；CCK-8試劑盒(編號ck04)購于日本同仁生物有限公司；Hoechst 33258凋亡檢測試劑盒(編號C1011)、蛋白預染Maker、熒光標記的二抗、ECL化學發(fā)光液購于上海碧云天生物有限公司。

1.2 實驗動物20只SD大鼠，雄性，體質量(180～200)g，清潔級，購于安徽省動物實驗中心(合格證號：皖醫(yī)動準2019-01)，每天光照 ∶黑暗周期(12 h ∶12 h)，自由進食飲水。

1.3 實驗方法

1.3.1實驗動物分組、建模和標本收集 20只SD大鼠隨機均分成兩組：正常組、模型組。模型鼠采取0.1 mL FCA注射入左后足趾皮內致炎，建模28 d后，戊巴比妥鈉麻醉下，腹主動脈內取血5 mL，放置試管中，離心后，將血清-20 ℃貯存待測氧化應激指標，應用分光光度計，硫代巴比妥酸法檢測MDA 含量，比色法測定GSH-Px活性，羥胺法檢測SOD活性。

1.3.2踝關節(jié)免疫組織化學染色 正常組和模型組SD大鼠致炎側踝關節(jié)組織，每組3只，置于10%福爾馬林溶液中固定48 h，10%硝酸溶液脫鈣2周，自來水沖洗過夜，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋，厚3 μm切片，60 ℃溫箱烤片1 h，枸櫞酸鈉緩沖液微波熱抗原修復，羊抗鼠SIRT3(1 ∶300)、羊抗鼠MnSOD(1 ∶200)單克隆一抗50 μL，濕盒4 ℃冰箱孵育過夜，PBS沖洗，加入37 ℃溫箱中生物素標記的二抗50 μL，蘇木精襯染，脫水、透明、中性樹膠封片，Nikon生物顯微鏡觀察并攝片。

1.3.3踝關節(jié)滑膜細胞培養(yǎng)、鑒定 按照本課題組前期建立的方法[10]，模型組大鼠FLS采取組織塊培養(yǎng)法，無菌超凈臺下，將致炎側踝關節(jié)附近的脂肪組織、肌腱和韌帶鈍性分離，眼科手術剪小心剝離滑膜組織，剪碎，放置于少量含20%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基的瓶中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)，待組織塊周圍長出較多細胞后，移除組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)，胰酶消化傳代，取培養(yǎng)第3～5代細胞，采用免疫熒光細胞化學，羊抗鼠Vimentin單克隆一抗(1 ∶200)，鑒定培養(yǎng)細胞是否為AA大鼠FLS。

1.3.4H2O2對FLS細胞增殖影響 采用CCK-8法試劑盒檢測，取對數(shù)生長期的FLS細胞，接種于96孔板中，每孔加入細胞3.0×103個/100 μL，次日待FLS細胞貼壁后，采取不同濃度的H2O2(0.1、0.5、1、3、5、10、20、40、80 μmol·L-1)處理24 h，每組細胞設5個復孔，以不含H2O2(0 μmol·L-1)的培養(yǎng)基為對照；全自動酶標儀，450 nm波長處測吸光度(absorbance，A)A450值，觀察AA大鼠FLS在H2O2處理后的增殖情況。

1.3.5Res對低濃度H2O2處理FLS細胞增殖影響 FLS細胞接種于96孔板中貼壁，CCK-8法檢測。根據1.3.4實驗結果，取使FLS細胞增殖活躍的低濃度H2O2(5 μmol·L-1)預先處理24 h，細胞貼壁生長，加入不同濃度的Res(0、1、5、10、20、40、80、160 μmol·L-1)處理24 h后，每孔加入10 μL的CCK-8繼續(xù)培養(yǎng)4 h。觀察波長450 nm處酶標儀測定吸光度A450值。

1.3.6HE染色觀察Res對低濃度H2O2處理FLS細胞凋亡情況 取對數(shù)生長期的AA模型FLS，1×106/孔接種于6孔板中，低濃度H2O2(5 μmol·L-1)處理FLS細胞貼壁生長24 h后，實驗分4組：AA模型FLS組、Res給藥組(終濃度為 5、20、40 μmol·L-1)處理24 h，吸棄培養(yǎng)基，每孔加入少量4%多聚甲醛液固定細胞15 min，PBS清洗，Triton X-100透化10 min，吸干后，每孔滴加Hoechst 33258染色液50 μL，避光染色15 min，PBS清洗，熒光顯微鏡觀察攝片。

1.3.7Western blot檢測Res對低濃度H2O2處理FLS細胞氧化應激相關蛋白的表達 取對數(shù)生長期細胞，6孔板中接種1×106/孔FLS，培養(yǎng)24 h后，RIPA細胞裂解液提取總蛋白，離心后取上清液，蛋白定量后，SDS-PAGE電泳，轉膜，脫脂奶粉室溫封閉，羊抗鼠SIRT3(1 ∶3 000)、羊抗鼠MnSOD(1 ∶2 000)、羊抗鼠β-actin(1 ∶2 000)單克隆一抗50 μL，4 ℃孵育過夜后，TBST緩沖液充分洗膜，兔抗羊二抗室溫中孵育2 h，TBST洗膜，ECL化學發(fā)光，曝光、顯影、定影。

2 結果

2.1 AA大鼠血清氧化應激指標如Tab 1所示，與正常對照組比較，AA模型組大鼠血清MDA含量升高，GSH-Px含量降低，SOD活性下降，兩組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，表明AA模型大鼠機體處于氧化應激狀態(tài)。

2.2 踝關節(jié)免疫組織化學染色結果正常組大鼠踝關節(jié)SIRT3蛋白表達不明顯(Fig 1A)，而模型組大鼠踝關節(jié)滑膜組織、軟骨組織中SIRT3蛋白表達明顯增強，陽性染色呈黃色或棕黃色(Fig 1B)。相似的，MnSOD蛋白在正常大鼠踝關節(jié)陽性表達不明顯(Fig 1C)，而模型組大鼠踝關節(jié)滑膜和軟骨組織中陽性表達明顯增強，以關節(jié)表面滑膜組織及下方軟骨組織最為明顯(Fig 1D)。

Tab 1 Changes of MDA, GSH-Px content and SOD activity in the serum of the two groups of rats

**P<0.01vsnormal

Fig 1 Results of immunohistochemical staining of ankle jointA.SIRT3 protein expression in normal rat; B. SIRT3 protein expression in model rats;C. MnSOD protein expression in normal rats; D.MnSOD protein expression in model rats

2.3 FLS培養(yǎng)、傳代和鑒定采取組織塊培養(yǎng)法，待FLS長出AA大鼠踝關節(jié)組織，移去組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)，胰酶消化并傳代培養(yǎng)，取3～5 代FLS細胞實驗，波形蛋白Vimentin是FLS的分子標記物，采用免疫熒光細胞化學染色，結果如Fig 2所示。

2.4 過氧化氫對滑膜細胞增殖的影響不同濃度的H2O2處理AA大鼠FLS 24 h后，將對照組(H2O20 μmol·L-1)的細胞活力設為100%，結果表明，在H2O2濃度在0.1～5 μmol·L-1間，F(xiàn)LS細胞增殖活力逐漸增加，隨著H2O2濃度升高，F(xiàn)LS細胞活力呈下降趨勢。表明在低濃度H2O2(≤5 μmol·L-1)刺激下，可能促進AA大鼠FLS增殖。見Fig 3。

2.5 Res抑制低濃度H2O2的AA大鼠FLS增殖預先在培養(yǎng)的FLS中加入低濃度H2O2(5 μmol·L-1)處理24 h后，然后Res處理(終濃度 1、5、10、20、40、80、160 μmol·L-1)，以未加Res(0 μmol·L-1)處理為對照組，Res作用24 h后，結果見Fig 4，可見加入1～160 μmol·L-1Res后，抑制了低濃度H2O2處理的FLS增殖，且當Res處理終濃度超過5 μmol·L-1時，差異有顯著性(P<0.05，P<0.01)。

Fig 2 Vimentin immunofluorescent staining in synovial cells of AA rats (×400)

Fig 3 FLS cell proliferation in AA rats treated with different concentrations of *P<0.05,**P<0.01 vs H2O2 (0 μmol·L-1)

Fig 4 FLS of AA rats proliferation inhibiting by different concentrations of Res with low concentrations of *P<0.05, **P<0.01 vs Res (0 μmol·L-1)

2.6 Res誘導過低濃度H2O2的AA大鼠FLS的凋亡培養(yǎng)的FLS中加入低濃度H2O2(5 μmol·L-1)處理24 h后，Res(0、5、20、40 μmol·L-1)作用于AA大鼠FLS 24 h后，在熒光顯微鏡下，Res(0 μmol·L-1)對照組細胞數(shù)目多，細胞核呈均勻藍色熒光，Res低濃度(5 μmol·L-1)作用后FLS有散在的核染色質聚集、碎裂，Res高濃度(20、40 μmol·L-1)作用后，細胞凋亡現(xiàn)象明顯，表現(xiàn)為較多的FLS細胞核染色質聚集、碎裂。見Fig 5。

Fig 5 Immunofluorescence staining by Hoechst 33258A：Res(0 μmol·L-1)，B：Res(5 μmol·L-1)，C：Res(20 μmol·L-1)，D：Res(40 μmol·L-1)

2.7 Res降低線粒體氧化應激相關蛋白的表達Western blot結果表明，與低濃度H2O2處理的對照組Res(0 μmol·L-1)比較，Res不同濃度(5、20、40 μmol·L-1)作用下，SIRT3、MnSOD蛋白表達降低(Fig 6A)；統(tǒng)計處理表明(Fig 6B)，隨著Res的濃度的增加，SIRT3、MnSOD表達量與內參照β-actin比值呈濃度依耐性的降低，較對照組差異有顯著性(P<0.05，P<0.01)。

3 討論

RA患者病變關節(jié)的主要病理特征為增生增厚的滑膜組織中血管翳形成，F(xiàn)LS和大量炎性細胞，包括淋巴細胞和巨噬細胞浸潤到關節(jié)組織結構中，破壞局部關節(jié)，故FLS在RA發(fā)病過程中至關重要[1]。過多的炎性細胞因子刺激活化巨噬細胞分泌ROS，成為關節(jié)損傷的媒介[11]。MDA是生物膜脂質過氧化產物，反映機體細胞ROS損傷后氧化損傷狀態(tài)，GSH-Px和SOD是抗ROS損傷的重要酶類，GSH-Px可等活化還原型谷胱甘肽(GSH)，促進H2O2等過氧化物降低，保護細胞膜結構完整性。本研究構建AA模型大鼠為動物模型，先檢測大鼠機體氧化應激狀況。結果表明，與正常組比較，AA模型大鼠血清MDA含量上升，GSH-Px含量下降和SOD活性降低，說明AA模型組大鼠機體存在氧化應激現(xiàn)象。

Fig 6 Effect of Res on the expressions of SIRT3 and MnSOD protein in A: typical Western blot;B: semi-quantitative analysis n=3),*P<0.05,**P<0.01 vs Res (0 μmol·L-1)

在RA發(fā)病過程中，F(xiàn)LS起著關鍵性作用，增生活躍的FLS激活促炎性因子，促進ROS生成，成為關節(jié)損傷一個重要因素[12]。本研究成功分離和培養(yǎng)FLS，并經過鑒定培養(yǎng)細胞為FLS；同時，低濃度(≤5 μmol·L-1)H2O2可促進AA大鼠FLS增殖，故本研究中，我們應用低濃度H2O2(5 μmol·L-1)刺激FLS生長，驗證Res對AA大鼠FLS增殖和凋亡作用。Res屬于多元酚類化合物，存在于多種水果和蔬菜中，具有廣泛的抗氧化和抗衰老等功效。細胞增殖實驗證實，Res能夠抑制低濃度H2O2處理FLS的增殖，且與Res濃度呈正相關；同時，Res能夠濃度依賴性的增加低濃度H2O2處理FLS的凋亡，但Res誘導FLS凋亡的機制尚不明確。

SIRT3是位于線粒體中的SIRTs家族成員，能夠調節(jié)線粒體乙酰化蛋白脫乙酰基，調節(jié)能量代謝；MnSOD是真核生物細胞線粒體中的金屬抗氧化酶，可清除超氧陰離子自由基，具有抗氧化損傷作用[12]。SIRT3可以脫乙酰化MnSOD 122位的賴氨酸殘基，激活MnSOD，降低ROS生成，從而具有抗氧化作用[13]。本研究證實，AA大鼠關節(jié)滑膜組織中SIRT3、MnSOD高表達；體外蛋白免疫印跡檢測證實，通過低濃度H2O2處理后，AA大鼠FLS細胞中SIRT3和MnSOD高表達，不同濃度Res處理后，低濃度H2O2處理的AA大鼠FLS細胞增殖明顯受到抑制，F(xiàn)LS凋亡增加，SIRT3、MnSOD蛋白表達也降低，表明Res可能通過降低線粒體SIRT3- MnSOD信號通路蛋白而具有抗FLS增殖作用。

(致謝:感謝安徽醫(yī)科大學組胚教研室和形態(tài)實驗中心的老師和同學們在實驗過程中給予的幫助)