阿司匹林通過抑制β-catenin/EMT信號通路促進5-FU誘導食管癌細胞凋亡

黃燕花，王魯妮，劉 澤，劉 凌

(南部戰區總醫院干部病房五科，廣東 廣州 510010)

食管癌是常見的消化道腫瘤，其發病存在明顯的地域差異，以東亞多見，我國是食管癌發病大國。由于大部分患者就診時已經處于食管癌晚期，已失去手術治療機會，預后極差，其5年生存率僅為30%左右[1]。針對晚期食管癌患者，臨床上多采用聯合放化療，5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)作為食管癌化療的常用藥，難免出現耐藥，因此增加其化療敏感性，延緩耐藥發生，對于食管癌患者的治療至關重要。阿司匹林(aspirin，ASA)是目前廣泛應用的解熱鎮痛藥，研究表明阿司匹林還有抗腫瘤作用,阿司匹林的使用可減少胃腸癌、乳腺癌、前列腺癌、食管癌等發病率和死亡率[2]。

上皮細胞間充質細胞轉化(epithelial mesenchymal transition,EMT)是指上皮細胞表型改變、黏附能力減弱、極性丟失后導致細胞運動、侵襲能力增強[3]。EMT不僅促進腫瘤發生以及侵襲轉移，而且還能增強腫瘤細胞的抗凋亡能力[4]，從而誘導化療耐藥[5]。研究表明食管癌患者化療后殘余腫瘤細胞發生EMT與化療耐藥相關[6]，提示抑制EMT可能為提高食管癌化療敏感性的潛在靶標，而阿司匹林是否可通過作用于該通路，從而抑制食管癌細胞增殖、誘導細胞凋亡，尚待研究。

目前關于阿司匹林與5-FU聯合協同抗食管癌的相關研究仍未見報道。本實驗擬通過阿司匹林聯合5-FU作用于體外培養的ECA109細胞，觀察阿司匹林是否可以增加5-FU化療敏感性，抑制腫瘤細胞增殖能力，促進其凋亡，在此基礎上明確其作用機制，從而為臨床上應用阿司匹林作為5-FU治療食管癌時的輔助用藥提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料人食管癌細胞株ECA109購自中山大學細胞庫；DMEM高糖培養液(11995500BT)、胎牛血清(10270)、0.25%胰蛋白酶(25200-056)購自美國Gibco公司；阿司匹林(A2093)、氟尿嘧啶(F6627)購自Sigma-Aldrich公司；抗體 cleaved caspase-3(#9661)、Bcl-2(#3498)、E-cadherin(#3195)、N-cadherin(#13116)、β-catenin(#8480)購自CST signaling；GAPDH(10494)，PCNA(10205)購自 proteintech公司，凋亡試劑盒(AD10)，CCK-8(CK04)檢測試劑盒購自日本東仁化學公司。

1.2 實驗儀器CO2恒溫培養箱(RSBiotech)；酶標儀(BMG CLARIOstar? Plus)；流式細胞儀(BD LSRFortessa)；倒置熒光顯微鏡(olympus IX71)；化學發光儀(Tanon 4600)；電泳儀(北京六一)。

1.3 實驗方法

1.3.1細胞培養 人食管癌細胞株ECA109培養于含有10%FBS、1%青霉素和鏈霉素加DMEM高糖培養液，置于37 ℃，5% CO2培養箱內,每3～4天用0.25%胰蛋白酶消化，1 ∶3進行傳代，取對數生長期細胞進行試驗。

1.3.2CCK-8法檢測細胞增殖 ECA109細胞胰酶消化,制備單細胞懸液，1×104細胞接種于96孔板中，于培養箱中培養，24 h候待細胞貼壁，每孔加入含0、0.062 5、0.125、0.25、0.5、1、2 g·L-1阿司匹林，0、0.01、0.02、0.1、0.2、0.5、1 mg·L-1的5-FU的培養基，設置無細胞DMEM培養基為對照組；作用24 h后，每孔加入10% CCK-8 100 μL，繼續孵育2 h，于酶標儀檢測450 nm 處吸光度，并計算不同藥物對細胞增殖影響。

1.3.3細胞凋亡檢測 采用日本東仁凋亡檢測試劑盒，細胞分4組進行處理：空白對照組，0.125 g·L-1阿司匹林組，0.1 mg·L-15-FU組，0.125 g·L-1阿司匹林+0.1 mg·L-15-FU組，六孔板培養24 h后，胰酶消化，PBS洗3次，100 μL binding buffer重懸，每管加入5 μL PI，5 μL Annexin V冰上孵育15 min，再加入400 μL binding buffer。1 h內進行流式檢測。

1.3.4Western blot檢測 核蛋白采用碧云天核蛋白提取試劑盒，細胞分四組進行處理：空白對照組，0.125 g·L-1的阿司匹林組，0.1 mg·L-1的5-FU組，0.125 g·L-1阿司匹林+0.1 mg·L-15-FU為聯合組。總蛋白采用RIPA細胞裂解液，100 ∶1加入PMSF，12 000轉4 ℃離心15 min，取上清，加入5X上樣緩沖液，將樣品放入100 ℃煮沸5 min，蛋白變性后放于-80 ℃保存備用。SDS-PAGE凝膠電泳，濃縮膠恒壓80 V，40 min，分離120 V，80 min。轉至PVDF膜，200 mA恒流，2 h。5%BSA封閉1～2 h，TBST洗2次，一抗4 ℃孵育過夜。TBST洗3次，二抗孵育1.5 h，TBST洗3次，ECL發光。ImageJ軟件分析灰度值。

2 結果

2.1 5-FU、阿司匹林單用或聯用對食管癌ECA109細胞增殖的影響CCK-8檢測結果，如Fig 1所示，采用不同濃度的阿司匹林(0.062 5、0.125、0.25、0.5、1、2 g·L-1)分別干預ECA109細胞，發現阿司匹林對ECA細胞的增殖有不同程度抑制作用，并呈濃度依賴性，但只有當阿司匹林濃度≥0.25 g·L-1，與空白組比較差異具有顯著性(P<0.05)。采用不同濃度的5-FU(0.01、0.02、0.1、0.2、0.5、1 mg·L-1)分別干預ECA109細胞，當5-FU濃度≥0.02 mg·L-1,與空白組比較差異具有顯著性(P<0.05)。將0.125 g·L-1和0.25 g·L-1濃度的阿司匹林分別與0.1 mg·L-1濃度的5-FU聯合應用于ECA109細胞，細胞增殖都能被更有效抑制。提示低濃度無毒性阿司匹林能加強5-FU對ECA109細胞增殖抑制作用。

Fig 1 Effects of aspirin and 5-FU alone or their combination on proliferation of ECA109 cells n=3)NC: Negative control, ASA: Aspirin. *P<0.05, **P<0.01 vs NC, #P<0.5, ##P<0.01 vs 5-FU, △△P<0.01 vs 5-FU+ASA

1：NC; 2: ASA (0.125 g·L-1); 3: ASA (0.25 g·L-1); 4: 5-FU(0.1 mg·L-1)；5：5-FU(0.1 mg·L-1)+ASA(0.125 g·L-1)； 6：5-FU(0.1 mg·L-1)+ASA(0.25 g·L-1)

2.2 5-FU 和阿司匹林單用或聯用對食管癌ECA109細胞凋亡的影響如Fig 2顯示，與對照組(8.3%±0.7%)相比，單用阿司匹林組(8.9%±0.7%)對細胞的凋亡無影響(P=0.36),5-FU組(13.5%±0.8%)使ECA199細胞的凋亡率升高(P=0.001)。5-FU與阿司匹林聯合用藥組(23.7%±4.8%)對ECA109細胞的凋亡效率明顯高于5-FU組(P=0.024)。

2.3 5-FU 和阿司匹林單用或聯用對凋亡蛋白Bcl-2和cleaved caspase-3表達的影響進一步采用Western blot檢測凋亡蛋白的表達。如Fig 3所示，與單用5-FU組比較(Bcl-2：0.83±0.14；cleaved caspase-3：0.61±0.11)，5-FU+阿司匹林組聯用組(Bcl-2：0.34±0.13，P=0.013；cleaved caspase-3：0.91±0.14，P=0.043)處理ECA109細胞會誘導Bcl-2蛋白表達顯著下調、cleaved caspase-3蛋白表達顯著上調。與空白組相比，單用低濃度阿司匹林對Bcl-2 和cleaved caspase-3蛋白表達無影響。提示低濃度無毒性阿司匹林加強5-FU誘導食管癌細胞凋亡。

Fig 2 The apoptotic rate of ECA109 cells treated by single aspirin, 5-FU or their n=3)NC: Negative control, ASA: Aspirin. **P<0.01 vs NC, #P<0.5 vs 5-FU

2.4 阿司匹林通過抑制ECA109細胞EMT提高5-FU化療敏感性在EMT期間，上皮細胞逐漸失去鵝卵石樣上皮的形態，變成呈紡錘形間充質形態，大多數由此產生的間充質細胞可以逆轉恢復上皮細胞狀態，稱為間質上皮轉化[7]。如Fig 4所示，EMT形態學變化，經過低濃度阿司匹林處理后ECA109細胞從紡錘型外觀變成鵝卵石樣形態，提示阿司匹林促使腫瘤細胞發生間質上皮轉化。如Fig 3所示，EMT分子水平表現上，與對照組(N-cadherin：1.34±0.16；E-cadherin：0.47±0.1；β-catenin：0.70±0.09)相比，阿司匹林單用處理ECA109細胞后均會誘導細胞顯著下調間質性蛋白N-cadherin(N-cadherin：0.84±0.10，P=0.01)、上調上皮標記蛋白E-Cadherin(E-cadherin,：1.26±0.14；P=0.01)和下調β-catenin蛋白(β-catenin:0.39±0.02,P=0.004)。與5-FU單用組比(N-cadherin：1.29±0.14；E-cadherin：0.79±0.16；β-catenin：0.69±0.05)，5-FU 和阿司匹林聯用組也能下調N-cadherin(0.42±0.10,P=0.001)、上調E-cadherin(1.24±0.16,P=0.026)、下調β-catenin(0.33±0.08，P=0.003)蛋白表達。

Fig 3 Effects of aspirin and 5-FU alone or their combination on protein expression of Bcl-2, cleaved caspases-3, N-cadherin, E-cadherin and β-catenin in ECA109 n=3)NC: Negative control; ASA: Aspirin; ECA: E-cadherin; NCA: N-cadherin; cl-c3: Cleaved caspases-3. *P<0.5, **P<0.01 vs NC, #P<0.5, ##P<0.01 vs 5-FU

Fig 4 EMT in ECA109 cells promoted by aspirin

3 討論

目前臨床上食管癌治療中，5-FU是一線化療藥物之一，因化療耐藥單藥化療有效率僅為10%～25%，聯合化療雖然能提高化療效率卻增加化療毒副作用[8]。同時5-FU的毒副作用呈劑量依賴性，對骨髓和消化道毒性較大，能否將本身無毒副作用且增加化療有效性的藥物與5-FU 聯用，既可減少5-FU的使用劑量，又可提高5-FU藥效是近年關注的焦點。阿司匹林能增強抗腫瘤作用，但阿司匹林有增加出血的風險。研究指出服用常規劑量(≥75 mg·d-1)阿司匹林能增加94%嚴重消化道出血發生率，53%顱內出血風險和47%腦出血風險[9]。我們希望服用低劑量阿司匹林不影響其抗腫瘤效果，且不增加消化道出血風險，但關于最低有效劑量的定義目前尚無統一標準。歐洲(阿司匹林50～325 mg·d-1)[10]和中國(阿司匹林80 mg·d-1)[11]的前瞻性研究均發現長期低劑量服用阿司匹林可降低癌癥發病風險，包括肝癌、胃癌、胰腺癌、食管癌、白血病等。有文獻報道阿司匹林聯合5-FU應用于HT-29 結腸癌細胞，通過誘發凋亡取得較好抗腫瘤作用[12]。目前尚無阿司匹林聯合5-FU協同抗食管癌的研究，本研究主要探討無明顯細胞毒性劑量阿司匹林增強5-FU對食管癌增殖抑制、誘導凋亡作用。

誘導腫瘤細胞凋亡是腫瘤治療的有效策略，當細胞凋亡受到抑制時，可引起腫瘤細胞耐藥[5]。5-FU耐藥的重要原因之一，便是凋亡抑制[13]。阿司匹林抗腫瘤作用也可通過抑制腫瘤細胞活性、破壞腫瘤微環境、抑制腫瘤細胞炎癥、調節腫瘤細胞免疫、阻止腫瘤侵襲和轉移、破壞對腫瘤細胞死亡的抵抗力并誘導細胞死亡等[14]。本研究證實，雖然單藥無毒性劑量阿司匹林對ECA109細胞凋亡、增殖無影響，但與5-FU聯用時，可明顯增加ECA109細胞凋亡率，提示低劑量阿司匹林協同5-FU誘發更多食管癌細胞發生細胞凋亡。細胞凋亡是受多種基因精確調控的主動的、程序化的死亡過程。作為凋亡蛋白，Bcl-2是抑制凋亡基因，下調可誘導腫瘤細胞凋亡，發揮協同促凋亡效應；cleaved caspase-3是caspase級聯反應下游效應分子，是細胞凋亡過程中最關鍵的執行者。Western blot檢測證明5-FU抑制抗凋亡Bcl-2蛋白的表達和促進cleaved caspase-3蛋白表達，進而誘導ECA109細胞發生凋亡，且阿司匹林能增強5-FU促凋亡效果。與既往研究不同的是，文獻指出高濃度阿司匹林可下調Bcl-2蛋白和上調caspases-3蛋白進而誘發膽管癌細胞[15]凋亡，由于本研究采用無毒性低濃度，單用阿司匹林對Bcl-2和caspase-3蛋白表達和凋亡均無影響。

EMT的發生不僅促進腫瘤細胞的侵襲和轉移，也與腫瘤耐藥密切相關。腫瘤細胞在產生耐藥的過程中常伴隨著間質化的改變，而具有間質化的改變的腫瘤細胞也常變現為耐藥的特點。發生EMT的腫瘤細胞常可獲得凋亡抑制而抑制EMT可促進腫瘤細胞凋亡[4]。EMT的發生常伴隨細胞形態的改變(獲得紡錘狀/成纖維細胞形態)、上皮細胞標志蛋白丟失(E-cadherin)、間充質細胞標志蛋白上調(N-cadherin、vimentin等)、細胞外基質的改變等。β-catenin/E-cadherin黏附復合體對維持上皮完整起著其中重要作用，當發生EMT時，β-catenin從黏附復合體中大量釋放至細胞質而入核，同時伴隨E-cadherin表達下調，N-cadherin表達上調。本研究表明阿司匹林可通過減少核內β-catenin含量，誘使N-cadherin下調、E-cadherin上調，進而抑制ECA109細胞的EMT進程，提示抑制β-catenin/EMT信號通路是阿司匹林協同5-FU抑制ECA109細胞增殖、促進ECA109細胞凋亡重要機制。

綜上所述，在低濃度無毒性阿司匹林作用下，5-FU抑制ECA109細胞增殖、誘導ECA109細胞凋亡的作用增強，其機制可能與抑制β-catenin/EMT信號通路有關。本研究為阿司匹林聯合5-FU應用于食管癌治療，提高5-FU化療敏感性提供了參考依據。下一步我們擬構建荷瘤小鼠模型，體內實驗驗證阿司匹林聯合5-FU對食管癌的影響。

(致謝：本實驗在南方醫科大學中心實驗室完成，在此感謝所有對本實驗支持和幫助的人。)