JMJD3對STAT3的調控在阿霉素心肌病中的作用研究

蘭 蕊, 郭 楨，李珍珍，路 靜, 劉培慶

(中山大學藥學院，廣東 廣州 510006)

阿霉素(doxorubicin，DOX)，又名多柔比星，是一種廣譜的蒽環類抗生素。自1960年被臨床上廣泛用于抗腫瘤，特別是針對肺癌、乳腺癌、白血病、淋巴癌等效果顯著[1]。但DOX由于具有嚴重的心臟毒副作用，從而限制了其臨床應用。目前DOX已經被大量用于復制細胞及動物水平的心肌病模型，為心肌保護的新機制、新靶點研究及藥物的篩選奠定基礎。DOX誘導的心肌細胞損傷，主要呈現擴張型心肌病的病理學特征：激活心肌細胞凋亡信號通路，線粒體功能紊亂，心功能下降等[2]。活性氧(release of oxygen species，ROS)的產生被認為是DOX心肌病的經典機制，但抗氧化劑并沒有顯示出很好的抵抗DOX心肌病的效果[3]，提示該疾病的發生發展機制可能更為復雜。

組蛋白去甲基化酶(histone demethylase Jumonji D3，JMJD3)，又稱為KDM6b(lysine-specific demethylase 6b)，主要分布于細胞核[4]。JMJD3可以將發生了甲基化修飾的甲基去除，進而激活或者抑制相關基因的表達。目前有文獻報道[5]，JMJD3在腫瘤、炎癥、細胞增殖分化、神經退行性疾病中發揮重要作用。此外，我們實驗室前期研究發現，JMJD3能夠通過調節β-MHC啟動子區域的H3K27me3程度來影響異丙腎上腺素誘導的病理性心肌肥大，且JMJD3在心臟中高表達[6]，這表明JMJD3與心臟疾病可能存在密切關系。但JMJD3與DOX誘導的擴張型心肌病是否有關，尚未見報道。

信號轉導與轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)作為STAT家族重要一員，在心臟疾病中也發揮著重要的作用[7]。有臨床研究表明，在心臟中過表達STAT3能夠緩解DOX引起的心臟毒副作用[8]。STAT3蛋白在細胞質、細胞核以及線粒體中廣泛分布，STAT3可以有效減少mPTP的開放，進而抑制細胞凋亡[9]。線粒體靶向過表達STAT3能夠顯著減少ROS的生成和細胞色素C的釋放[10]。此外，STAT3在其他疾病中也發揮重要作用，比如，激活mTOR-STAT3信號通路能夠改善脂多糖誘導的血管內皮屏障功能障礙和細胞凋亡，有助于減少微血管損傷和肺損傷[11]。

關于JMJD3在DOX心肌病中的功能學研究及JMJD3是否通過調控STAT3磷酸化水平，進而參與對DOX心肌病調控，目前尚未見報道?；诖?，本文探究了JMJD3對STAT3的調控作用及其在DOX心肌病中的機制，為心肌保護新靶點的尋找提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料阿霉素(DOX，純度>99 %，美國 Boston，T1020)；胰酶(美國 Sigma，25200-072)；BCA蛋白定量試劑盒(美國 Pierce，23225)；胎牛血清(美國Gibco，10270-106)；Bax抗體、JMJD3抗體(英國 Abcam，ab32503、ab169197)；STAT3抗體、p-STAT3(Ser727和Tyr705)抗體(美國CST，9139S、9134T和9145P)；Caspase-3抗體(美國 ProteinTech，19677-1-AP)；Bcl-2抗體(中國 Boster， A0040-1)；Cleaved Caspase-3抗體(美國 CST，9661T；以上抗體稀釋比是1 ∶1 000。α-Tubulin抗體 (美國 Sigma-Aldrich，T6199，稀釋比1 ∶2 000)；兔二抗、鼠二抗(美國 CST，7074S，7076S，稀釋比1 ∶2 000)；腺病毒JMJD3、STAT3和陰性對照GFP(吉凱基因，中國上海)；RNA逆轉錄試劑盒(美國 Thermo，K1622)；TRIzol(日本 TaKaRa，9109)。

1.2 儀器超凈工作臺(中國蘇凈安泰)；熒光定量PCR儀(美國Thermo)；二氧化碳培養箱(美國Thermo)；冷凍臺式高速離心機(德國Eppendorf)；恒溫水浴鍋(德國Memmert)；蛋白電泳儀、電轉儀(美國Bio-Red)；倒置顯微鏡(德國Leica)；化學發光圖像分析系統(中國Tanno)。

1.3 方法

1.3.1細胞培養 心肌細胞系H9C2購于中國科學院細胞庫，用含10%胎牛血清的DMEM培養，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中孵育，待細胞充分貼壁生長至密度達70%～80%，棄培養基，用PBS緩沖液沖洗3次，加入含0.25% EDTA胰酶進行消化，離心后加入新的含10%胎牛血清的DMEM重懸細胞，根據實驗需要將細胞接種于細胞皿中，取對數生長期的細胞進行實驗。

1.3.2RT-qPCR (1)RNA提取:將H9C2細胞或心肌組織用PBS清洗，加入1 mL TRIzol，細胞輕柔吹打，組織于冰上勻漿，收集液體至1.5 mL EP管中。加入200 μL氯仿，震蕩、靜置、離心。將上層轉移至新的EP管中，加入異丙醇，室溫放置后離心10 min，棄上清。加入1 mL 用DEPC水配置的75 %的乙醇，離心后棄上清，在室溫下干燥20 min。加入15-20 μL DEPC水，于58 ℃恒溫水浴10 min，隨后測定RNA 的濃度及純度。(2)逆轉錄合成cDNA:根據Thermo公司提供的RvertAid cDNA 試劑盒說明書構建體系。第一步，將試劑Oligo(dT)18 primer、Total RNA、RNase Free dH2O按說明書劑量在冰上混勻，瞬離后放入PCR儀中65 ℃孵育5 min；第二步：按說明書劑量將5×Reaction Buffer、RiboLockTM RNase Inhibitor、dNTP Mix、RevertAidTM M-MuLV Revert混勻加入至上一步產物中，體系總體積為20 μL，瞬離后放入PCR儀中，設置反應參數42 ℃×60 min，70 ℃×5 min，最后降溫至4 ℃。(3)PCR擴增: 首先在Pubmed Primer BLAST 網站設計目的基因的引物序列，如下：JMJD3：正向5′- TCAGGAGAGGAAGGCCTCAG-3′，反向5′-AGCTGGGTATGGATGAGGGT-3′；β-actin：正向5′-TCGTGCGTGACATTAAAGAG-3′；反向5′-ATTGCCGATAGTGATGACCT-3′。本實驗的引物委托上海生工合成。根據Toyobo公司生產的SYBR Premix ExTaq說明書構建反應體系，實驗設計三個復孔以及空白對照，瞬離5 s后放入qPCR儀中，設置參數為：95 ℃×1 min；95 ℃×15 s；60 ℃×30 s 循環50次；95 ℃×15 s；60 ℃×1 h； 65 ℃×30 s，循環61次。內參基因為β-actin，分析數據方法均采用2-ΔΔCt法。

1.3.3阿霉素心肌病動物模型的建立 SPF級Sprague-Dawley大鼠，♂，體質量(260±20)g，購買于中山大學實驗動物中心，動物質量合格證(No 44008500018368)。隨機分為2組，分別為生理鹽水對照組(NS)和阿霉素模型組(DOX)，每組6只。將鹽酸阿霉素粉末用生理鹽水配置成濃度為0.5 g·L-1的溶液，模型中SD大鼠于d 1、5、9給予腹腔注射阿霉素(1 mL·100 g-1)，每次劑量為5 mg·kg-1，最終累積劑量為15 mg·kg-1[2]。對照組SD大鼠給予腹腔注射等體積的生理鹽水。所有動物實驗流程均嚴格按照《Guide for the Care and Use of Laboratory Animals》執行。

1.3.4SD大鼠心室壁注射JMJD3腺病毒 采用腹腔注射10%水合氯醛(0.35 mL·100 g-1)的方法待大鼠麻醉后，將其固定，將特質的氣管插管經口腔插入氣道中，連接呼吸機以輔助呼吸。剔除大鼠仰臥位左側胸腔處的鼠毛并用碘伏擦拭消毒。開胸腔：在大鼠左側第3～4根胸骨之間剪開一個約2～3 cm小口，暴露心臟。用胰島素針將200 μL JMJD3腺病毒(用無菌PBS緩沖液稀釋為5×109PFU)分散成3～5個位點注入左心室壁?？焖倏p合、消毒，觀察大鼠傷口愈合情況，待恢復1周后，可進行后續實驗。

1.3.5超聲心動檢測 用4%異氟烷經小動物麻醉機將大鼠麻醉，剔除胸部皮毛，使其平躺于37 ℃恒溫板。用超聲心動儀檢測SD大鼠的各項心功能指標。

1.3.6心臟組織取材 對SD大鼠給予腹腔注射0.45%戊巴比妥鈉(45 mg·kg-1)進行麻醉。消毒后迅速打開胸腔，灌注0.1 mol·L-1KCl溶液使心臟在舒張期停搏，隨后灌注生理鹽水除去淤血，快速取出心臟，用濾紙吸去多余液體后進行稱重、拍照。沿橫截面進行分切，隨后凍存于液氮中用于后續Western blot等實驗。

1.3.7心肌細胞及心臟組織總蛋白提取 心肌細胞：棄去培養基，預冷PBS清洗，加入100 μL RIPA裂解液(含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑)，刮下細胞，冰上孵育30 min，在4 ℃，12 000 g 條件下離心20 min，取上清。BCA法測定蛋白濃度并制備樣品。

心臟組織：稱取約15 mg 組織于離心管中，剪碎，加入預冷PBS，棄上清后加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，于冰上勻漿。在4 ℃，12 000 g 條件下離心15 min，取上清。BCA法測定蛋白濃度并制備樣品以備后續檢測。

1.3.8蛋白免疫印跡法 制備12 %和8 % SDS-PAGE凝膠,上樣后設置電泳條件為80 V ×35 min，進入分離膠后調整參數為120 V ×65 min，轉膜條件240 mA×100 min。5 %脫脂牛奶封閉2 h，4 ℃孵育一抗過夜，TBST清洗，室溫孵育二抗1 h，拍照、灰度值分析。

1.3.9細胞水平干預目的基因 過表達JMJD3及STAT3：采用JMJD3或STAT3腺病毒感染的方法處理H9C2細胞48 h，對照組加入含綠色熒光蛋白的腺病毒(Ad-GFP)。腺病毒購買于上海吉凱基因化學技術有限公司。

敲低JMJD3：將細胞接種于8 cm2培養皿中，用250 μL Opti-MEM培養基分別與5 μL Lipo2000、10 μL濃度為20 μmol·L-1的JMJD3干擾序列輕柔混勻，靜置25 min后加入培養皿中，6 h后更換新的含10% DMEM的培養基繼續培養。JMJD3干擾序列為：sense：5′-GCCUUCAUGCGAGUAACAUTT-3，antisense：5′-AUGUUACUCGCAUGAAGGCTT-3′。NC干擾序列為：sense：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，antisense：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′[6]。

2 結果

2.1 JMJD3在DOX誘導的心肌細胞損傷模型的變化采用1 μmol·L-1DOX分別刺激H9C2細胞0、6、12、24 h，Fig 1A～B結果顯示，與正常對照組相比，當DOX處理細胞12 h和24 h時，細胞發生明顯凋亡：凋亡相關蛋白Bax/Bcl-2、C-Caspase-3/T-Caspase-3比值升高(P<0.05)，明場下觀察到凋亡細胞數目增多。TMRE染色結果顯示，DOX處理細胞12 h和24 h時，細胞膜電位發生明顯下降(Fig 1C)。以上結果提示，1 μmol·L-1DOX刺激細胞12 h，可明顯誘導心肌細胞損傷。在此模型下，JMJD3的mRNA和蛋白表達水平明顯增高(Fig 1D～E)。

2.2 JMJD3在DOX誘導的大鼠心肌病模型的變化與生理鹽水對照組(normal saline, NS)相比，DOX組的大鼠心臟橫截面直徑變小(Fig 2A)，心動圖紊亂(Fig 2B)，心重脛骨長比降低，但心重/體重比值無明顯變化(Fig 2C)，左室射血分數(ejection Fraction, EF)降低，心輸出量降低(cardiac output, CO)，左室短軸縮短率(fractional shortening, FS)降低(Fig 2D)，舒張期末左室后壁厚度(left ventricular end-diastolic posterior wall thickness, LVPW-d)降低(Fig 2E)。qRT-PCR結果顯示，與NS組相比，DOX模型組大鼠心臟組織中JMJD3的mRNA表達明顯升高(Fig 2F)。采用Western blot方法檢測JMJD3的蛋白表達：與NS組相比，DOX組大鼠心臟組織中JMJD3的蛋白表達明顯升高(Fig 2G)。

2.3 過表達JMJD3對心肌細胞凋亡的影響在H9C2細胞中加入JMJD3腺病毒感染48 h，由Fig 3可知，JMJD3過表達成功。與對照組相比，過表達JMJD3組的切割型Caspase-3(C- Caspase-3)表達水平升高，提示凋亡因子Caspase-3被激活，且過表達JMJD3可以加劇DOX引起的Caspase-3的激活。

2.4 敲低JMJD3對心肌細胞凋亡的影響在細胞水平敲低JMJD3后，與對照組相比，敲低JMJD3處理組C-caspase-3/T-caspase-3比值差異沒有顯著性。與DOX處理組相比，si-JMJD3+DOX處理能夠明顯抑制切割型caspase3的激活(Fig 4)。

2.5 JMJD3與STAT3對DOX誘導的心肌細胞凋亡的影響如Fig 5A結果顯示：單獨過表達STAT3(Ad-STAT3)對心肌細胞凋亡無明顯影響；與DOX模型組相比，DOX合并Ad-STAT3組，可以減輕DOX引起的Bax/Bcl-2以及C-caspase-3/T-Caspase-3的升高；與Ad-JMJD3+DOX處理組相比，Ad-STAT3+Ad-JMJD3+DOX處理組中的Bax/Bcl-2以及C-Caspase-3/T-Caspase-3明顯下降。這些結果提示，JMJD3可能是通過抑制STAT3表達，從而加劇DOX誘導的心肌細胞凋亡的作用。

Fig 1 Changes of JMJD3 expression in doxorubicin(DOX)-induced H9C2 cells were incubated with 1 μmol·L-1 DOX for the indicated durations. A:The ratios of Bax/Bcl-2 and C-Caspase-3/T-Caspase-3 were detected by Western blot. B:The cellular morphology of H9C2 was observed by light microscopy. Scale bar: 200 μm. C:The mitochondrial membrane depolarization was measured by TMRE staining. Scale bar: 100 μm.D: The mRNA expression of JMJD3 was detected by qRT-PCR.(E) The protein expression of JMJD3 was determined by Western blot.*P<0.05 vs control group.

Fig 2 JMJD3 expression increased in DOX-induced SD rats were submitted to the intraperitoneal injected with DOX(with a cumulative dose, 15 mg·kg-1). The control animals obtained an equal volume of normal saline(NS).A： The gross hearts were obscured by morphologic examination. Scale bar: 5 mm. B： Representative echocardiographic graphs. C： The ratios of HW/BW, HW/TL were detected. D～E：Parameters of Cardiac function of EF, CO, FS, LVPW-d were detected by echocardiographic. F： The mRNA expression of JMJD3 was detected by qRT-PCR. G： The protein expression of JMJD3 was determined by Western blot.*P<0.05 vs NS group.

Fig 3 JMJD3 overexpression aggravated DOX-induced H9C2 cells were incubated with 1 μmol·L-1 DOX for 12 h or infected with adenovirus encoding JMJD3(Ad-JMJD3) or GFP(Ad-GFP). The intracellular protein expression of JMJD3 and Caspase 3 were determined by Western blot.*P<0.05 vs Ad-GFP group,#P<0.05 vs Ad-GFP+DOX group

由Fig 5B可以看出，與對照組相比，DOX心肌病細胞模型中STAT3的蛋白表達及磷酸化水平降低；過表達JMJD3也可降低STAT3的蛋白表達及磷酸化水平；與Ad-GFP+DOX組相比，DOX合并過表達JMJD3對STAT3的蛋白表達及磷酸化水平的變化差異無統計學意義，提示二者并未出現疊加作用。

Fig 4 JMJD3 knockdown relieved H9C2 cells were incubated with 1 μmol·L-1 DOX for 12 h or transfected with siRNA targeting JMJD3(si-JMJD3) or NC.(A) The intracellular protein expression of JMJD3 and Caspase-3 were determined by Western blot.*P<0.05 vs NC group,#P<0.05 vs NC+DOX group.

3 討論

DOX心肌病的作用機制復雜，氧化應激和細胞凋亡被認為是主要機制[12]。心肌細胞在DOX刺激下，經過各類氧化還原酶的作用，在線粒體、肌漿網、胞質中形成半醌自由基，該自由基可與醌環之間形成循環，進而傳遞電子給O2，并產生大量的ROS[13]。大量研究表明，DOX進入細胞，能夠直接引起細胞壞死、凋亡及自噬。本實驗發現JMJD3在DOX心肌細胞毒性模型中呈現時間依賴性上調；且在整體動物模型中同樣表達升高，提示JMJD3可能參與了DOX心肌病發生發展過程。

JMJD3是含有JmjC結構域的組蛋白去甲基化酶家族的重要成員之一，在腫瘤、炎癥、細胞增殖分化、神經退行性疾病中發揮重要作用[5]。有研究證實，JMJD3通過水解組蛋白H3K27me3上的甲基進而去除其對基因轉錄的抑制[14]。我們實驗室在前期研究證實，JMJD3通過調節β-MHC啟動子區域的H3K27me3程度，改變β-MHC表型向α-MHC轉化，進而影響異丙腎上腺素誘導的心肌肥大[6]。在本實驗中，過表達JMJD3檢測凋亡相關蛋白的變化，發現JMJD3單獨即引起心肌細胞凋亡，也可以加重DOX誘導的細胞凋亡。

Fig 5 Effects of JMJD3 and STAT3 on DOX-induced H9C2 cells were incubated with 1 μmol·L-1 DOX for 12 h or infected with Ad-JMJD3,Ad-STAT3 or Ad-GFP. A:The ratios of Bax/Bcl-2 and C-Caspase-3/T-Caspase-3 were analyzed by Western blot.*P<0.05 vs Ad-GFP group;#P<0.05 vs Ad-GFP+DOX group; △P<0.05 vs Ad-JMJD3+DOX group. B:The protein expressions were detected by Western blot.*P<0.05 vs Ad-GFP group;#P<0.05 vs Ad-GFP+DOX group.

STAT家族在調節多種生物功能過程中發揮著重要作用，迄今發現該家族7個成員，分別是STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B和STAT6，它們可被細胞因子、生長因子激活，進而調節基因的轉錄[7]。有文獻報道，STAT3可以保護DOX引起的心肌細胞凋亡和線粒體損傷[8]。我們發現，過表達STAT3可以減輕Ad-JMJD3和DOX引起的心肌細胞凋亡，這提示STAT3可能參與了JMJD3對DOX心肌病的調控過程。

心血管疾病如心衰、心肌肥大、擴張型心肌病等發病機制復雜，其發生發展與營養-環境及基因的改變密切相關。近年來，從表觀遺傳學角度研究眾多疾病機制成為研究熱點，表觀修飾對基因的選擇性轉錄表達的調控成為研究表觀遺傳學與疾病關系的重要內容[6]。本研究中的JMJD3本身是重要的組蛋白去甲基化酶，STAT3作為轉錄因子與JMJD3之間存在調控關系，從表觀遺傳的角度出發，我們猜測可能是JMJD3通過其組蛋白修飾的作用抑制STAT3的轉錄，進而引起心肌細胞損傷。本實驗通過過表達JMJD3發現其可以抑制STAT3的蛋白表達及其磷酸化水平。但是關于JMJD3與STAT3之間具體是如何調控的，是否與JMJD3對STAT3啟動子區域的H3K27me3水平的影響有關，這是我們今后的研究方向之一。