基于抗氧化能力檢測白藜蘆醇產品中反式異構體含量的方法

王思淵，郭 彬，陳 蓉，郝 剛*，梅建鳳

(1 蘇州市藥品檢驗檢測研究中心，蘇州 215000；2 浙江工業大學 藥學院，杭州 310014)

白藜蘆醇是一種作用廣泛的天然多酚類化合物，是在植物遭受外界脅迫時產生的一種植物抗毒素，主要存在于葡萄等漿果類植物中，目前已在100種植物中被發現。近年來的研究表明，白藜蘆醇具有多種生物活性和藥理作用，尤其在抗氧化、抗腫瘤和治療心血管疾病方面有非常顯著的作用，可廣泛應用于醫藥、食品、化妝品和保健品等領域[1-2]。白藜蘆醇能夠通過與自由基反應來降低自由基活性，阻止自由基的進一步鏈式反應，達到清除自由基的效果[3-4]。研究發現，白藜蘆醇的強抗過氧化作用與其結構密切相關，由于反式結構分子都位于一個平面，捕捉自由基后，表現出更加穩定的狀態，反式構型比順式構型對Cu2+鰲合能力強，抑制誘導的低密度脂蛋白氧化作用也更為明顯[5]。在生物合成和應用的產品中，白藜蘆醇往往以順式構型和反式構型混合的形式存在，因此，產品中反式構型的含量檢測就變得尤為重要[6]。目前市售白藜蘆醇產品多不區分順反式異構體，僅表述為白藜蘆醇純度?，F有順反式構型分析的方法主要以特殊色譜條件下的高效液相色譜法為主，存在耗時長、耗材昂貴等缺點[7-8]，目前尚無快速高通量分析方法的報導。本文利用白藜蘆醇順反式異構體間抗氧化能力的差異，建立ABTS+·清除率法測定白藜蘆醇產品反式構型的含量，為白藜蘆醇的推廣利用提供快速有效的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

Spectra Max Plus 384型全波長酶標儀(賽默飛世爾科技有限公司)；XSE205型分析天平(梅特勒-托利多國際有限公司)；反式白藜蘆醇和順式白藜蘆醇標準品(HPLC純度均≥99%，Cayman Chemical有限公司)；總抗氧化能力檢測試劑盒(ABTS法，上海碧云天生物技術有限公司)；總抗氧化能力檢測試劑盒(ABTS法，西安赫特生物科技有限公司)；抗氧化檢測試劑盒(西格瑪試劑)；其余試劑均為市售分析純；5批次不同白藜蘆醇原料藥采購自市場。

1.2 溶液的配制

將ABTS溶液與氧化劑溶液等體積混合均勻，配制ABTS母液。ABTS母液室溫避光存放16 h后，以80%乙醇稀釋至A734為(0.7±0.05)，制成ABTS工作液。精密稱定反式白藜蘆醇和順式白藜蘆醇標準品溶于80%的乙醇中制成對照品溶液。精密稱定5批次不同白藜蘆醇原料藥溶于80%的乙醇，配制成0.1 mmol/L的溶液，作為供試品。

1.3 白藜蘆醇順反式異構體抗氧化能力測定

參照Miller等[9]和Rice-Evans等[10]的研究方法，分別精密稱取反式白藜蘆醇和順式白藜蘆醇標準品溶于80%的乙醇，配制成0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 mmol/L的溶液。在96孔板上加入 200 μl 的ABTS工作液，加入10 μl樣品后，輕輕搖勻。室溫孵育6 min后，測定白藜蘆醇順反式異構體各濃度A734，并按公式(1)計算ABTS+·清除率。

(1)

式(1)中：A1為樣品+ABTS 試劑的A734；A2為80%乙醇+ABTS 試劑的A734；A3為樣品+80%乙醇的A734。

1.4 白藜蘆醇異構體含量標準曲線的建立與方法學研究

以0.1 mmol/L的反式白藜蘆醇和順式白藜蘆醇標準品溶液配制成體積比為0∶100、20∶80、50∶50、80∶20和100∶0的混合溶液，即混合溶液中反式白藜蘆醇含量比例分別為0%、20%、50%、80%和100%。按“1.3”所述方法測定各比例溶液ABTS+·清除率，以反式白藜蘆含量比例為橫坐標，ABTS+·清除率繪制標準曲線，得回歸方程。以80%反式白藜蘆醇混合溶液作為樣品進行方法學研究，考察反應溶液的穩定性、重復性、耐用性。

1.5 白藜蘆醇產品含量檢測

將采購獲得的5批不同廠家的原料藥白藜蘆醇，精密配制成濃度為0.1 mmol/L的溶液，測定樣品的ABTS+·清除率，依據“1.3”中的標準曲線，由清除率計算出反式白藜蘆醇的濃度比例，再將比例乘以0.1 mmol/L，即可計算出樣品反式白藜蘆醇的含量。

2 結果

2.1 白藜蘆醇順反式異構體抗氧化能力比較

不同濃度的順反構型白藜蘆醇異構體的ABTS+·清除率如圖1所示。在低濃度條件下，由于酶標儀檢測限與試劑盒靈敏度的影響，測得的順反式白藜蘆醇溶液ABTS+·清除率差異不大。隨著2種白藜蘆醇異構體濃度的增加，測得的順反式白藜蘆醇溶液ABTS+·清除率差異顯著，在濃度為0.1 mmol/L時，順式白藜蘆醇溶液ABTS+·清除率為13.2%，反式白藜蘆醇溶液ABTS+·清除率為81.5%，是前者的6.17倍。但隨著溶液濃度的進一步提升，由于試劑盒反應能力飽和，超出線性范圍，測得的順反構型白藜蘆醇溶液ABTS+·清除率差異開始變小。故選定濃度為0.1 mmol/L的反式白藜蘆醇/順式白藜蘆醇混合溶液，構建白藜蘆醇異構體含量標準曲線。

圖1 白藜蘆醇順反異構體的ABTS+·清除率曲線

2.2 白藜蘆醇異構體含量標準曲線的建立

按前文所述方法，測定濃度為0.1 mmol/L時，反式白藜蘆醇和順式白藜蘆醇混合液中不同反式異構體含量比例溶液的ABTS+·清除率，繪制的標準曲線見圖2。

圖2 不同含量比例的反式白藜蘆醇的ABTS+·清除率標準曲線

由圖2得出的反式白藜蘆醇含量比例與ABTS+·清除率之間的回歸方程為y=0.677x+11.26，R2=0.9943，說明兩者在反式白藜蘆醇含量比例0%～100%之間線性關系良好。依據這個回歸方程，只要測定白藜蘆醇樣品在濃度為0.1 mmol/L時的ABTS+·清除率，即可計算出反式白藜蘆醇的含量比例，比例乘以0.1 mmol/L，即可得到樣品中反式白藜蘆醇含量。如果樣品的ABTS+·清除率小于11.26%(橫坐標為零時的縱坐標值)，不適用本快速檢測方法測定。

2.3 方法學研究

2.3.1溶液穩定性考察

將配制好的ABTS工作母液與ABTS工作液室溫避光存放12、24、36和48 h，考察反應溶液的穩定性。發現配制好的ABTS工作母液室溫避光存放，在48 h內穩定。制成的ABTS工作液室溫避光存放，在24 h內穩定。由于白藜蘆醇順反式異構體在光照條件下存在可逆互變反應，建議供試品溶液臨用現配并避光保存。

2.3.2重復性試驗

取80%反式白藜蘆醇混合溶液6份，按“2.1”所述方法測定，考察重復性。測得反式白藜蘆醇含量均值為79.5%，相對偏差為0.52%(n=6)。結果見表1。

表1 重復性試驗結果

2.3.3耐用性考察

取80%反式白藜蘆醇混合溶液為供試品，用3種不同品牌試劑盒測定，考察方法耐用性。測得反式白藜蘆醇含量均值為79.6%，標準偏差為0.77%，結果見表2，表明該方法耐用性良好。

表2 耐用性實驗結果

2.4 白藜蘆醇產品中反式異構體含量的檢測

按前文所述方法，測定了5個白藜蘆醇原料藥中反式白藜蘆醇的含量，結果見表3。從表3數據可以看出，測得的5個白藜蘆醇原料藥樣品中反式異構體含量為其標示量差值百分比均小于1%，說明通過測定白藜蘆醇產品的抗氧化能力，計算反式白藜蘆醇的含量的方法可行，可應用于白藜蘆醇相關產品中反式構型含量的檢測。

表3 白藜蘆醇原料藥中反式異構體的含量測定結果

3 討論

現有的白藜蘆醇順反式構型分析的方法主要以特殊色譜條件下的高效液相色譜法為主，存在耗時長、耗材昂貴等缺點。由于白藜蘆醇順反式異構體存在可逆互變反應，耗時長的分析方法不利于結果的準確性，需建立快速高通量的分析方法。本文利用反式白藜蘆醇ABTS+·清除率與順式白藜蘆醇之間的差異性，建立了濃度均為0.1 mmol/L條件下，兩者混合溶液中反式異構體含量比例與ABTS+·清除率之間關系的標準曲線，得到回歸方程。只要測定樣品在濃度為0.1 mmol/L時的ABTS+·清除率，再由回歸方程計算出反式白藜蘆醇的含量比例，比例乘以0.1 mmol/L，即可得到樣品中反式白藜蘆醇含量。結果表明，本研究建立的方法具有較高的穩定性、重復性和耐用性。用該方法測定了5個白藜蘆醇原料藥產品，結果與它們標示量的差值百分比均小于1%，說明該方法能夠快速可靠、重復性好地測定白藜蘆醇產品反式異構體的含量。因此，本研究為白藜蘆醇反式異構體快速檢測方法的建立提供了實驗依據。