ELISA法檢測中藥材及中藥飲片真菌毒素的探討

柯 穎，徐昕怡，洪小栩*

(1 中國藥科大學，南京 210009；2 國家藥典委員會，北京 100061)

隨著我國中醫藥產業的快速發展，中藥材與飲片使用人群范圍日益擴大，市場需求不斷增長。由于產地分布廣、加工企業多、制備工藝各異及成分復雜多變等，給中藥材與飲片的質量控制帶來極大的挑戰，保障中藥材與飲片安全性顯得尤為重要。中藥材與飲片的安全性問題，涉及內源性有毒成分和外源性有毒有害物質污染。內源性安全考慮主要針對中藥自身含有的毒性成分，如生物堿類、苷類、萜類、金屬元素類等，可引起肝損傷、腎毒性、呼吸系統損害等不良反應。有毒中藥材與飲片治療窗較窄，在臨床用藥方面有一定的風險，需要嚴格控制這些已知毒性成分的含量。外源性污染主要涉及重金屬及有毒有害元素、農藥殘留，特別是有機氯類農藥，此類物質可在人體內累積，對人體的正常功能造成傷害。中藥材與飲片微生物污染問題也不容忽視，特別是在生產以及加工儲運過程中，如不采取有效措施加以控制，極易造成外源微生物的污染，其中可能存大量致病菌和某些真菌毒素，導致中藥材與飲片存在一定的安全性風險隱患，給臨床使用帶來安全性問題。

1 真菌毒素污染控制

中藥材與飲片的種植、采收、炮制、運輸、貯藏等各環節都有可能引入或加重真菌毒素的污染。研究發現，目前存在150余種真菌，可產生的真菌毒素約有400種，其中約有200種可對人和動物造成危害[1]。這些真菌毒素一般表現為慢性毒性和協同性，毒素在人體內能夠累積，造成DNA損傷，具有致癌性、致突變性或致畸性等，一旦攝入將嚴重威脅到人類生命健康[2]。世界衛生組織(WHO)已將黃曲霉毒素(Aflatoxins, AFT)認定為 ⅠA 級危險物，其中毒性最強的黃曲霉毒素B1(AFB1)半數致死量為0.36 mg/kg體重[3]。根據聯合食品添加劑專家委員會(JECFA)規定的每日耐受攝入量[tolerable daily intake, TDI，μg/(kg·d)]，玉米赤霉烯酮(Zearalenone, ZEN)、伏馬毒素(Fumonisins, FB)、赭曲霉毒素A(Ochratoxin A, OTA)和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol, DON)的TDI分別為0.2、2.0、17.1和1.0 μg/(kg·d)[4]。

為保障中藥材、飲片或植物藥使用安全，各國都極其重視對真菌毒素污染的控制。中國、日本和歐洲等藥典均對易霉變的中藥材與飲片制定了相應真菌毒素檢測方法和限量標準，在控制種類上主要是針對真菌毒素中毒性較大、危害性較高的AFT、ZEN、FB、OTA和DON等(見表1)。

表1 國內外藥典對真菌毒素檢測的收載情況

①:AFs=AFB1+AFB2+AFG1+AFG2；
②：*、**、***和****分別表示測定相應品種AFT、ZEN、FB和OTA的含量。

目前，國內外普遍采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)以及高效液相色譜-串聯質譜法(high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS)檢測毒素(見表2)。《中國藥典》2015年版在采用HPLC法基礎上，增加HPLC-MS檢測技術，進一步強化檢測手段，提升檢測能力，可檢測60余種真菌毒素。

表2 中藥材真菌毒素檢測方法比較

2 真菌毒素的檢測(ELISA法)

酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法是基于免疫學建立的檢測技術。其原理是抗原與抗體的特異性結合。將抗原或抗體吸附在固相載體表面，抗原或抗體可通過共價鍵與酶形成酶結合物，根據加入底物顯色程度進行結果判定[5]。ELISA法由于靈敏度高，特異性好，大分子蛋白質類物質可作為抗原免疫動物來獲得特異性抗體，因此在生物藥檢測領域廣泛應用。ELISA法可分為6種類型(見表3)，其中常用的是雙抗原夾心法和間接法。一般小分子物質不具有免疫原性，不適宜ELISA法建立。真菌毒素相對分子質量低且僅含單個抗原決定簇，屬于半抗原。但將真菌毒素通過共價鍵與大分子載體蛋白偶聯[6]，可形成全抗原，用于制備高特異性的單克隆抗體，使得ELISA法用于真菌毒素的檢測成為可能。

表3 ELISA法的檢測方法分類

ELISA法檢測靈敏度可達到pg級別，具有操作簡便、檢測時間短、檢測通量大、對檢測環境和設備要求不高的特點，更適合中藥材與飲片中真菌毒素檢測的實際需求[7]。

3 ELISA法與HPLC法比較

HPLC法是各國藥典普遍采用的真菌毒素檢測方法。其原理是以高壓條件下的液體為流動相，并采用固相萃取柱的色譜分離技術，以反向高效液相色譜法最為常用[8]。通過計算色譜峰的面積來確定其含量。近年來，HPLC-MS或LC-MS/MS檢測由于具有極強的特異性已被用于多種真菌毒素的檢測[9]。

ELISA法與HPLC法在前處理和檢測過程中對供試品的處理和操作不同，對測定結果的影響程度也有所差別。針對真菌毒素檢測方法的應用，目前也有不少研究機構采用ELISA法檢測試劑盒與HPLC法進行比對，以進一步對ELSIA法在真菌毒素檢測的適用性進行評估。

3.1 供試品的前處理

合理的前處理過程是檢測可靠性的前提。由于真菌毒素殘留水平較低，中藥材與飲片種類繁多，基質復雜，且其來源及生產企業加工處理方式各異，無論采用哪種檢測方法，無疑都將面臨極大的挑戰。前處理技術主要包括真菌毒素的提取、純化、富集等過程。提取溶劑的選擇主要取決于待測毒素的種類、性質以及待測毒素在提取溶劑中的溶解度和非測定成分在提取溶劑中的分配系數，以便最大限度地提取目標毒素。真菌毒素一般在酸性或中性條件下穩定，所以通常需要提高溶劑體系中水相的pH值。常見的提取方法有一步提取法、QuEChERS(quick,easy,cheap,effective,rugged,safe)法、加速溶劑萃取法等。一步提取法具有操作簡單、成本低等特點，但是易引入雜質，適用于靈敏度較高、對供試品前處理要求較低的質譜檢測方法。QuEChERS法是近年來國際上最新開發的一種農產品檢測的快速樣品前處理技術,其有機試劑用量少，準確度和精密度高，可實現對中藥材與飲片多種真菌毒素的同時提取和凈化，適用于同一藥材多種真菌毒素的同時檢測。

純化與富集過程是為了獲得更高的選擇性和靈敏度，除去干擾雜質(如脂類、蛋白質、色素等)，保留待測組分。目前常用的純化方法有免疫親和柱凈化法、固相萃取柱凈化法及柱色譜法等，其中免疫親和柱法凈化特異性強，純化效果好，因此應用最為廣泛[10]。ELISA法與HPLC法前處理過程的比較見表4。

表4 ELISA與HPLC兩種方法在供試品前處理過程的比較

3.2 方法比較

已有相關文獻報道，采用ELISA法和HPLC法對加標檢測供試品中真菌毒素的含量進行測定，通過供試品回收率統計結果比對，對兩個方法的準確性和抗干擾性進行綜合評估(見表5)。

表5 ELISA法與HPLC法測定真菌毒素回收率結果的對比[11-16]

從發表文獻的數據結果看，對于某些藥材，ELISA法的回收率和精密度結果與HPLC法檢測結果基本接近，有些檢測供試品的回收率甚至高于HPLC法，說明ELISA法具有較好的特異性?；厥章屎蜋z測偏差總體均在可接受范圍之內，可用于中藥材與飲片真菌毒素的檢測。

ELISA法存在的供試品回收率超過100%的情況，表明供試品在前處理和分析過程中損失較少，也有可能存在供試品內源性和外源性物質干擾，或者存在一定程度的同類型毒素免疫交叉反應。HPLC法的回收率偏低可能是由于供試品提取液經免疫親和柱純化后有損失，或者是柱后洗脫時，沒有處理好控制流速，造成洗脫不完全[17]。在結果準確度的比較上，總體上，HPLC法的精密度比ELISA法高，說明HPLC法的重復性好，準確度較高，穩定性好。

3.3 應用的考慮

針對檢測供試品干擾因素的不確定性，ELISA法應建立適用性評估技術要求，以保障檢測結果的可靠性和穩定性。一是，建立適用性評估方法，供試品在檢測前應通過檢測加標回收率，確定干擾是否可接受的范圍，對供試品的方法適用性進行確認。對內源性或外源性物質干擾較大的供試品，可能存在不適用的問題。二是，為進一步加強檢測結果的可靠性，可根據每次檢測供試品加標回收率，建立相應的干擾影響系數，對檢測結果進行糾偏，排除干擾。三是，進一步完善和優化供試品前處理，包括采用固相萃取柱，并優化洗脫條件及相關參數設置。四是，規范正確的操作，減少人為誤差，保障結果的可靠性。

4 應用前景

隨著當前藥品全生產鏈條、全生命周期管理的理念的發展，加強源頭和生產過程的檢測，最大程度避免和降低中藥材與飲片中真菌毒素的殘留至關重要。建立簡便快捷、經濟實用、成本低廉的檢測方法顯得尤為必要。雖然目前中藥材與飲片真菌毒素的檢查還是以色譜法為主，但是這些分析方法操作復雜，設備昂貴，檢測環境要求高，檢測效率低，檢測成本高，而且檢測人員要熟悉儀器的操作，不適于大量樣品的篩查及快速檢測，制約了真菌毒素控制的實際應用。《中國藥典》2020年版擬納入真菌毒素檢測ELISA法，為有效控制中藥材與飲片真菌毒素污染又提供了一種技術選擇。

ELISA法的應用為未來中藥材與飲片真菌毒素快檢和篩查提供了廣闊的發展前景。免疫膠體金技術是近年來在酶聯免疫法的技術基礎上發展起來的一種新型快速檢測技術[18]。膠體金技術包括膠體金標記技術、免疫技術和固相層析技術[19]。當免疫膠體金顆粒遇到相應的真菌毒素抗原時會發生反應，產生聚集，在適宜的條件下達到一定的密度，可產生肉眼可見的顏色[20]。免疫膠體金技術適用于現場大通量快速檢測，樣品處理簡單，5～10分鐘就可以看到檢測結果。膠體金試紙條作為定性檢測，操作簡便、快捷，無須昂貴設備，操作人員不需要進行特殊培訓、檢測成本更加低廉，可應用于中藥材及中藥飲片真菌毒素的初篩檢測，極大方便了基層的實際應用和質量控制[21]，在實際監測中更具實用價值。

5 小結

我國的中藥材與中藥飲片市場急需進行規范管理，制定嚴格、完善的中藥質量標準也刻不容緩。要實現中藥產業的高質量發展，必須從源頭抓起，首先要提高中藥材質量。ELISA技術運用于中藥材質量檢測的發展，為中藥材質量檢測提供了一種重要手段。ELISA法簡便、快速，檢測覆蓋面大，節約了大量的人工成本，常用于定性分析和前期的大量初篩；免疫膠體金技術以其特異性強，檢測高效，作為高通量檢測方法，可用于現場篩選大量樣品，在中藥材及中藥飲片質量控制領域顯示出廣闊的應用前景。生產企業和監管機構可根據實際需要，采用新手段對中藥材與飲片進行風險評估。