柳州市柑橘黃龍病QPCR檢測及代謝物鑒定

史紫蘭

柑橘屬于國內第一大類水果品種，它的銷量大且種植面積廣。近年來，隨著柑橘種植規模的持續擴大的同時，也帶來了嚴重的病蟲害困擾，其中隱患較大的當屬柑橘黃龍病。柑橘黃龍病是柑橘生產中一直無法根治的大難題，給世界柑橘產業帶來了毀滅性危害。故此，也被稱為“柑橘癌癥”，可侵染各種柑橘類及其近緣屬作物。柳州市地處亞熱帶，有著豐富的柑橘品種和柑橘果園。本文實驗材料來自于廣西柳州市柑橘果園，選擇了廣西柳州市砂糖橘、溫州柑、南豐蜜桔、甜橙等四種感病柑橘品種進行黃龍病葉片的采集、處理。本試驗應用了CTAB法進行柑橘葉片的DNA提取以及熒光定量PCR檢測技術對葉片感病情況進行檢測。

一、柑橘黃龍病的田間調查

自2018年12月起，根據黃龍病的發病規律對柳州市柑橘果園的砂糖橘、溫州柑、南豐蜜桔、甜橙、沃柑、桔柚等主要品種出現的黃龍病疑似癥狀進行全面調查和分析，病害癥狀主要表現為葉片黃化、斑駁，出現“紅鼻子果”，以及果實口感酸澀等。根據病樹表現出的葉片、果實、枝干的表型特征，在田間進行初步診斷。根據黃龍病病菌主要集中在葉片中脈的特點，我們對樹齡相近、生長時期相近的柑橘病葉進行了采集。采摘有斑駁狀或類似黃龍病癥狀的枝葉，放入采樣袋中密封，用水洗凈灰塵拍照整理，帶回實驗室置于-80℃冰箱保存備用。

二、CTAB法提取柑橘黃龍病葉片DNA

手術剪用酒精燈消毒后分別取其主葉脈約100mg，加入液氮充分研磨至粉末狀，將粉末用EP管裝好置于-80℃冰箱保存備用。自行配制CTAB提取液。從柳州果園共采南豐蜜桔、甜橙、溫州柑、砂糖橘四個品種共50株，用CTAB法提取50個樣本的DNA并用超微量紫外分光光度計檢測DNA濃度和純度確保DNA濃度適宜做QPCR鑒定。

三、對黃龍病疑似癥狀采樣進行QPCR分子檢測確診

以篩選出的感病植株GG14作為陽性對照，對50個DNA樣品進行QPCR鑒定。定量PCR檢測方法的靈敏度等級非常高，在確保柑橘樣品DNA的純度和濃度的情況下，對比常規PCR靈敏度低的特點，可以優先考慮使用定量PCR。應用該技術對來自柳州柑橘果園的顯癥葉片進行實際檢測，檢測結果與田間診斷結果情況一致，表明本熒光定量PCR檢測方法可作為柑橘黃龍病早期診斷的靈敏、可靠、快速的檢測手段。QPCR結果如下：

四、基于GC-MS的柑橘葉片代謝物鑒定

取柑橘整葉片加液氮研磨成粉末，精確稱量50mg柑橘葉片樣品;放入2mL的離心管中;加入500？l提取液（甲醇：水=4：1）于樣品中;加入一顆鋼珠，低溫下高通量組織破碎儀破碎（50Hz，3min）;加入200uL氯仿，低溫下，高通量組織破碎儀破碎;（50Hz，3min）;渦旋混勻后，冰水浴超聲萃取30min;將樣品靜置于-20℃，30min;離心20min（12000rcf，4℃），取上清液裝入玻璃衍生瓶中，真空抽干;向玻璃衍生小瓶中加入80？L的甲氧胺鹽酸鹽吡啶溶液（15mg/mL），渦旋震蕩2min后，于震蕩培養箱中37°C中90min進行肟化反應;將樣本取出后再加入80？LBSTFA（含1%TMCS）衍生試劑和20？L的正己烷，渦旋震蕩2min后，于70℃反應60min;取出樣本后，在室溫放置30min，進行GC-MS代謝組學分析。

50組柑橘樣品代謝物定性結果如表2所示：

五、柑橘黃龍病的防治對策

到目前為止，黃龍病致病菌在離體條件下依然難以培養，基因改良育種的方式不能大規模普及應用，有待學者們更進一步的研究;對柑橘苗木脫毒處理能夠使病情有效延緩，但是從長遠看，柑橘苗木自身抵抗感染的能力并沒有增強。所以從源頭上不是能真正抑制病菌的方法;生物防治需要投入大量的時間、人力、物力，成本很高且見效時間長，也不宜廣泛采用;化學防治雖然見效快、能有效殺死黃龍病的傳播媒介—木虱，但同時也危害了自然環境，建議在柑橘園有效使用防蟲網，可以阻止病害蟲傳播。雖然簡單、有效地隔離柑橘木虱等傳播媒介病害蟲，從而抑制黃龍病的發生。也可以利用昆蟲的趨性，設置誘捕器等殺死黃龍病的傳播媒介害蟲。

（作者單位：530004 廣西大學）