CT23基因在腦腫瘤中的表達(dá)情況及臨床價(jià)值

鄭葆龍 肖紹文

摘要：目的 ?檢測(cè)和明確癌-睪丸相關(guān)抗原（CTA）CT23基因在人腦腫瘤中的表達(dá)情況，評(píng)估該基因潛在的臨床價(jià)值。方法 ?收集廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科14例顱腦腫瘤病理標(biāo)本，包括星形細(xì)胞瘤5例，髓母細(xì)胞瘤4例，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤5例，使用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)CT23基因在不同病理類型的腦腫瘤中的表達(dá)情況，比較其在不同類型腦腫瘤中的表達(dá)差異。結(jié)果 ?14例腦腫瘤樣本中13例CT23表達(dá)陽性，其中星形細(xì)胞瘤4例，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤5例，髓母細(xì)胞瘤4例，CT23基因在三類腦腫瘤樣本中的表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 ?CT23基因作為一種腫瘤相關(guān)的基因，可表達(dá)于多種類型的人類腦腫瘤中，另外該基因的表達(dá)與腦腫瘤的發(fā)生、發(fā)展可能有關(guān)。

關(guān)鍵詞：CT23基因;腦腫瘤;癌-睪丸抗原;逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

中圖分類號(hào)：R739.4 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.05.028

文章編號(hào)：1006-1959（2020）05-0094-03

Abstract：Objective ?To detect and clarify the expression of the cancer-testis-associated antigen （CTA） CT23 gene in human brain tumors， and to evaluate its potential clinical value. Methods ?Collected 14 cases of craniocerebral tumor pathological specimens from Neurosurgery Department of the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University， including 5 cases of astrocytoma， 4 cases of medulloblastoma， and 5 cases of glioblastoma. RT-PCR was used to detect the expression of CT23 gene in brain tumors of different pathological types， and to compare the expression difference of CT23 gene in different types of brain tumors.Results ?The CT23 gene expression was positive in 13 of 14 brain tumor samples， including 4 astrocytomas， 5 glioblastomas， and 4 medullary tumors. Comparison of CT23 gene expression in three types of brain tumor samples， the difference was not statistically significant （P>0.05）.Conclusion ?As a tumor-related gene， CT23 gene can be expressed in many types of human brain tumors. In addition， the expression of this gene may be related to the occurrence and development of brain tumors.

Key words：CT23 gene;Brain tumor;Cancer-testis antigen;Reverse transcription polymerase chain reaction

腦腫瘤（brain tumor）具有治療難度大，致死率高的特點(diǎn)，我國腦腫瘤發(fā)病率呈現(xiàn)出逐年增加的趨勢(shì)，嚴(yán)重影響了人民的健康。腦膠質(zhì)瘤是最常見的成人惡性腦腫瘤，約占顱內(nèi)腫瘤的17%[1]，發(fā)病率約為3/10萬[2]，具有惡性腫瘤的典型生物學(xué)特性，呈浸潤性生長(zhǎng)，腫瘤與周圍正常腦組織邊界不清[3]。有研究利用基因表達(dá)系統(tǒng)分析（SAGE）方法從人類睪丸cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)了CT23基因，該基因位于人類第12號(hào)染色體短臂1區(qū)2帶到1區(qū)3帶之間（12p12～13），全長(zhǎng)1933 bp，共10個(gè)外顯子，可以編碼543個(gè)氨基酸，特異性地定位于幾種物種的生殖細(xì)胞的頂體中，包括小鼠、豬、豚鼠和人[4]。CT23基因表達(dá)的相關(guān)抗原，在睪丸生精小管和人類眾多腫瘤組織中廣泛存在，如乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸直腸癌、骨髓瘤、前列腺癌、肝癌等[5-9]。研究表明[10]該抗原在精子中參與了獲能和頂體反應(yīng)，而在其他正常組織中卻幾乎不表達(dá)，根據(jù)該基因的這一特性，本研究認(rèn)為其有望成為用于判斷腫瘤類型和腫瘤免疫治療的理想靶分子[11]。因此，本實(shí)驗(yàn)通過探究CT23基因在多種類型的腦腫瘤中的表達(dá)，旨在為未來該基因的研究奠定理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1樣本來源 ?收集廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科腦腫瘤樣本14例，包括星形細(xì)胞瘤5例，髓母細(xì)胞瘤4例，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤5例。所有樣本均經(jīng)過病理學(xué)檢查，已通過廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審查和授權(quán)，相關(guān)操作符合世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言關(guān)于人體醫(yī)學(xué)研究的倫理準(zhǔn)則。所有新鮮腫瘤組織取自腫瘤切除后10 min內(nèi)立即用凍存管進(jìn)行分裝和標(biāo)記，然后放入液氮罐速凍，及時(shí)用液氮保溫瓶帶回實(shí)驗(yàn)室，放置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2設(shè)備及耗材 ?超低溫冰箱（青島海爾）超微量分光光度計(jì)（北京天根公司）電子天平PB602-N（上海精密科學(xué)儀器有限公司）低壓電泳儀（Bio-Rad公司）微量移液器（德國Eppendorf公司）普通PCR儀（德國Eppendorf公司）紫外線凝膠電泳成像分析系統(tǒng)（天能UV2000）電泳槽DYCP-31BM（六一儀器廠）臺(tái)式冷凍離心機(jī)（德國Eppendrof公司）離心管及PCR管（Axygen公司）。引物組織總RNA 提取試劑盒（Sangon公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，PCR反應(yīng)試劑盒（南京諾唯贊公司），溴化乙錠（Sigma公司）。

1.3除RNA酶 ?提取總RNA及逆轉(zhuǎn)錄過程中，除已標(biāo)明為Rnase-free的實(shí)驗(yàn)用品之外，其他塑料制品（如：EP管、離心管、移液器槍頭等）均需要進(jìn)行除RNA酶處理后方可使用。佩戴一次性口罩，一次性乳膠手套或PE手套，嚴(yán)格按照具體操作規(guī)范進(jìn)行，防止RNA酶污染導(dǎo)致的RNA提取失敗。

1.4提取總RNA ?取冰凍腫瘤組織（-80℃），天平秤取50 mg置于10 ml離心管中，再加入500 μl Buffer RL1（已加入β-巰基乙醇），離心管外加冰盒，用高速電動(dòng)勻漿器間斷高速勻漿1～2 min，將組織徹底研磨均勻，勻漿后震蕩2 min，室溫靜置備用。根據(jù)組織總RNA提取試劑盒（諾唯贊公司）說明書的有關(guān)步驟繼續(xù)進(jìn)行相應(yīng)的提取工作。提取完成的總RNA樣品，均進(jìn)過超微量分光光度計(jì)的檢測(cè)和瓊脂糖凝膠電泳的檢測(cè)，對(duì)符合要求的總RNA樣品直接進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

1.5 cDNA合成 ?CT23基因的特異性引物序列為：5-AAGGACAGGGGACTAAGGAG-3（上游引物），5-CCGTACAAATCCAGCCCGTA-3（下游引物）[12]。取2 μg總RNA，依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的相關(guān)步驟進(jìn)行RNA的逆轉(zhuǎn)錄，cDNA的質(zhì)量用人類管家基因GAPDH進(jìn)行檢測(cè)和判斷，GAPDH基因的引物序列和相關(guān)的PCR反應(yīng)條件均來源于文獻(xiàn)[13]。

1.6 RT-PCR反應(yīng) ?采用能夠特異性擴(kuò)增CT23基因的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件如下：預(yù)變性（94℃、5 min）、變性（94℃、1 min）、退火（59℃、1 min）、延伸（72℃、2 min）、循環(huán)數(shù)（35）、徹底延伸（72℃、8 min）。所有相關(guān)的擴(kuò)增反應(yīng)均采用已經(jīng)過確認(rèn)的陽性細(xì)胞株樣本作為陽性對(duì)照，用雙蒸水代替組織樣本的cDNA作為陰性對(duì)照，反應(yīng)結(jié)束后立即進(jìn)行濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳100 V、30 min，然后進(jìn)行凝膠成像并記錄相應(yīng)結(jié)果。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 ?實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用（n，%）表示，采用確切概率法或四格表？字2檢驗(yàn);當(dāng)P<0.05時(shí)表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

CT23的表達(dá)情況：CT23相應(yīng)引物可特異性擴(kuò)增出大小約600 bp的基因片段，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，該片段來源于CT23基因，14例腦腫瘤樣本中CT23陽性表達(dá)13例，基因陽性率約為92.86%（13/14），其中星形細(xì)胞瘤80.00%（4/5），膠質(zhì)母細(xì)胞瘤100.00%（5/5），髓母細(xì)胞瘤100.00%（4/4），CT23基因在三類腦腫瘤樣本中的表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。CT23基因表達(dá)凝膠成像見圖1。

3討論

近年來，腫瘤-睪丸抗原（cancer-testis antigen，CTA）家族受到越來越多的科研工作者的關(guān)注，CT23作為該家族的一員，也已經(jīng)開展了一系列的研究。目前有關(guān)該基因的研究主要集中于以下幾個(gè)方面：①基因表達(dá)及表達(dá)機(jī)制的研究：多個(gè)研究報(bào)道CT23基因在多種腫瘤中表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了CT23可在多種腦腫瘤中表達(dá)。②功能方面的研究：通過siRNA 在體外干擾CT23基因的表達(dá)，可明顯地減低降低細(xì)胞周期調(diào)控蛋白cyclin E，遷移/侵襲調(diào)節(jié)蛋白MMP2和MMP9的表達(dá)，有研究發(fā)現(xiàn)在體外下調(diào)CT23基因的表達(dá)可導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為減弱[14，15]以及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)周期停滯和遷移能力的減弱[16]，也可通過促進(jìn)有絲分裂過程中的紡錘絲的形成，來增加腫瘤細(xì)胞的遷移能力[4]。③CT23與免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的關(guān)系：該基因在結(jié)直腸癌患者體內(nèi)的表達(dá)可以引起患者的體液免疫應(yīng)答[17]，其中CT23抗原肽的表達(dá)可被CD8特異性識(shí)別[18]。

現(xiàn)在已知的抗體類標(biāo)記物大多來源于腫瘤相關(guān)抗原（tumor-associated antigen，TAA），腫瘤組織表達(dá)的特異性蛋白能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生非特異性免疫反應(yīng)和特異性免疫反應(yīng)，如細(xì)胞免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)[19]。已經(jīng)開展的有關(guān)癌-睪丸抗原的疫苗研究顯示出對(duì)患者預(yù)后的積極作用，因此CTA有望成為未來治療惡性腦腫瘤的潛在靶抗原（carcinoembryonic antigen，CEA），尤其是在一些腫瘤患者的體液或血液中已經(jīng)檢測(cè)到腫瘤相關(guān)抗體[20，21]，說明其在腫瘤早期診斷過程具有重要的輔助作用，具有很大研究潛力。

根據(jù)2016年世界衛(wèi)生組織公布的2007中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類第四版修訂版的最新分類標(biāo)準(zhǔn)，膠質(zhì)瘤的來源是神經(jīng)祖細(xì)胞，其中有IDH基因突變的為有IDH突變的神經(jīng)膠質(zhì)瘤;沒有IDH基因突變的膠質(zhì)瘤為IDH野生型星形細(xì)胞瘤。而髓母細(xì)胞瘤不屬于膠質(zhì)瘤，已被劃分到胚胎性腫瘤，這進(jìn)一步加強(qiáng)了有關(guān)原癌基因激活和相關(guān)致癌作用的機(jī)理研究。在臨床工作中，通過對(duì)癌基因的激活與變異的檢測(cè)，確定腫瘤的相關(guān)病理分類，明確能夠直接導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡或者直接引起腫瘤事件發(fā)生的相關(guān)基因是腫瘤分類的基礎(chǔ)和前提。自O(shè)no T 等[12]報(bào)道了人類 CT23基因以來，國內(nèi)外對(duì)CT23與腫瘤間的聯(lián)系進(jìn)行了較多的研究，如卵巢癌、大腸癌、乳腺癌、肝癌等，并預(yù)測(cè) CT23基因在腫瘤組織中的表達(dá)可能與臨床資料存在相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)CT23基因在人類腦腫瘤中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其具有較高的表達(dá)頻率，說明該基因具有成為靶向治療的靶點(diǎn)的潛力。

總之，本研究證實(shí)了CT23基因可表達(dá)于多種類型的人類腦腫瘤中，在未來的研究工作中，擬通過增加樣本量，在現(xiàn)有研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，獲得更加準(zhǔn)確的結(jié)論。同時(shí)，通過擴(kuò)大研究方法，如高通量測(cè)序技術(shù)、免疫組化及基因敲除等相關(guān)技術(shù)手段，對(duì)CT23基因進(jìn)行更深入的研究。

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收稿日期：2019-12-09;修回日期：2019-12-19

編輯/成森