紅外光譜法測定奶粉中三聚氰胺和尿素

白靜，王會

1(河南應用技術職業學院 化學工程學院，河南 鄭州，450042)2(河南應用技術職業學院 護理學院，河南 鄭州，450042)

三聚氰胺[C3N3(NH2)3],俗稱密胺，蛋白精，含氮量高達66.6%，白色無味，在水中微溶，價格低，具有低毒性，不能作為添加劑加入到食品中。但是有些不法商販作為“蛋白精”，加入飼料，奶制品，增加產品表現出的蛋白質含量，冒充蛋白質[1]。研究表明反復過量服用三聚氰胺會導致大頭、腎結石等多種疾病，危害人體健康[2]。

尿素又名脲，其水溶液呈中性，是有機氮肥中的一種。在乳及乳制品中摻雜尿素，可以增加乳中的氮含量，進而提高蛋白質檢測含量和增加密度。尿素含量測定在乳制品行業中具有十分重要的地位，其在乳及乳制品中的含量應低于0.70 mg/g[3]。而如果奶粉中的尿素含量超過正常范圍，也會導致潰瘍、癌癥、消化不良、胃酸、腎功能疾病等健康問題[2]。

目前國內外在測定奶粉中三聚氰胺和尿素的含量有很多種，如熒光光譜法[4]、近紅外成像技術[5]、紅外光譜法[6]、拉曼光譜法[7]、氣相色譜-質譜法[8]、高效液相色譜法[9]、利用非線性化學指紋圖譜法[10]、同位素稀釋質譜法[11]等。國標中規定測定奶粉中三聚氰胺和尿素的方法多采用滴定法和高效液相色譜法。

雖然這些方法測定奶粉中三聚氰胺和尿素的含量具有可行性，但是在其處理方面都有相應的缺陷。拉曼光譜法、非線性化學指紋圖譜法、熒光光譜法檢測速度快但易受干擾因素影響，成本較高且操作復雜；同位素稀釋法雖然精密度高，檢出限低，但是對操作要求過高，不能進行推廣研究。

紅外光譜法對樣品檢測無需進行復雜的預處理，建立模型后樣品可在1 min內完成檢測，對樣品基本無損耗；分辨率高，但是對于光譜掃描得到的數據龐大，不易分析，因此常將紅外光譜法結合化學計量學進行研究。

本文在研究紅外光譜在奶粉摻三聚氰胺和尿素的應用中，結合二階最小二乘法使用誤差項不相關的工具變量來計算有問題的預測變量的估計值，然后通過計算值來估計因變量的線性回歸模型。與常規的一元線性回歸相比，該方法能對復雜關系分析其顯著性并能去除異常點增加線性擬合程度[12]，對于奶粉中三聚氰胺和尿素的監控具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與樣品

雀巢全家營養奶粉市場購買；三聚氰胺(純度≥99%)，購自天津市大茂化學試劑廠；尿素(純度≥99%)，購自天津市大茂化學試劑廠；KBr(色譜純，純度≥99%)，購自天津市科密歐化學試劑有限公司。

尼高麗紅外光譜儀Nicolet 380FT-IR，馭锘實業(上海)有限公司；分析天平，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；瑪瑙研缽，湖南力辰儀器有限公司。

1.2 紅外光譜測定參數

IR光源，波數4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1、掃描速度0.632 9 cm/s、掃描次數32次，掃描之前均需先采集空白背景，紅外光譜儀預熱30 min以消除外界環境的影響,提高光譜數據的有效信息量[13]。對光譜數據采用平均平滑法進行預處理，選用平滑窗口大小為15，在此條件下能很好地去除各種因素產生的高頻噪聲。樣品數據光譜為3次掃描的平均值。每次壓片測量都需要將ZnSe 晶體、壓片螺母、瑪瑙研缽等用無水乙醇洗干凈、并置于日光燈下烤干，壓片應該透過性好并無裂痕。

1.3 三聚氰胺標準品梯度制備

將稱量瓶洗干凈放入烘箱中烘干，用分析天平(精度0.000 1)稱取不同質量分析純的三聚氰胺和溴化鉀，先將KBr置于研缽中研磨至粉末，再與三聚氰胺以逐步混勻法混勻，得到12個三聚氰胺標準品的梯度含量，置于稱量瓶中標記，并按照1.2光譜條件測定。

1.4 尿素標準品梯度制備

先將稱量瓶洗干凈放入烘箱烘干，稱取不同質量分析純的尿素和KBr，分別將KBr和尿素置于研缽研磨，再將尿素和KBr按照逐步混勻法混勻，得到12個尿素標準樣品的梯度含量，置于稱量瓶中標記，并按照1.2光譜條件測定。

1.5 樣品測定

稱取不同質量的三聚氰胺和奶粉，按照逐步混勻法混合均勻，得到3個摻入三聚氰胺的奶粉偽樣品三聚氰胺含量分別的為2.018 1、4.995 9、8.291 6 g/100g，置于稱量瓶中標記，并按照1.2光譜條件測定。同時依據GB/T22388—2008原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法中規定的高效液相色譜法對三聚氰胺進行測定。

稱取不同質量的尿素和奶粉，按照逐步混勻法混合均勻，得到3個摻入尿素的奶粉摻偽樣品，尿素含量分別為1.574 4、4.409 2、6.452 4 g/100g，置于稱量瓶中標記，并按照1.2光譜條件測定。同時依據GB/T 21704—2008乳與乳制品中非蛋白質含量測定中規定的滴定法對尿素進行測定。

2 結果與分析

2.1 三聚氰胺特征吸收峰確定

圖1 三聚氰胺和奶粉紅外光譜疊加圖Fig.1 Melamine and milk powder infrared spectrum superposition

三聚氰胺和奶粉是物理混合，對樣品混合的12組三聚氰胺標準品的光譜數據進行處理。

2.2 尿素特征吸收峰確定

圖2 尿素和奶粉紅外光譜疊加圖Fig.2 Infrared spectrum superposition diagram of urea and milk powder

由于尿素和奶粉是物理混合，對樣品混合的12組尿素標準品掃描后的紅外光譜數據進行處理。

對比尿素和奶粉紅外光譜疊加圖可以看出,尿素在538、1 157、1 450、1 628、1 655、3 350、3 418、3 470 cm-1處吸光度大，比較奶粉紅外光譜圖可知在1 628、1 655、3 350、3 418、3 470 cm-1四個點處吸光度較弱，并且隨著尿素含量的增大，吸光度在此4個點逐漸增大，符合朗伯比爾定律，因此對這4處吸收峰進行回歸分析，進而進一步確定最佳特征吸收峰進行定量分析。

2.3 奶粉摻三聚氰胺模型建立及回歸分析

三聚氰胺特征吸收峰為732、1 551 cm-1，按照1.2光譜條件進行的紅外光譜分析數據如表1所示。根據表1對三聚氰胺在732、1 551 cm-1處吸光度進行定量分析，建立一元線性回歸方程后發現在732 cm-1線性相關性為0.930 3，在1 551 cm-1線性相關性為0.993 3，因此選取1 551 cm-1為三聚氰胺特征吸收峰。

由表1可知，三聚氰胺的含量和1 551 cm-1吸光度呈現出一定的正相關關系，關系式如公式(1)所示：

Y=ax+b+c

(1)

式中：Y表示1 551 cm-1吸光度；x表示三聚氰胺的含量；c表示其他因素對吸光度的影響總和，比如KBr的質量、或者奶粉樣品的品種、噪聲對吸收峰的影響等，一般認為他們是相互獨立且服從正態分布的隨機變量。

表1 三聚氰胺特征吸收峰含量和吸光度Table 1 Characteristic absorption peak lontent and absorbance of melamine

通過SPSS軟件讀取表1中三聚氰胺含量(工具變量)，1 551 cm-1吸光度(因變量)，KBr質量(解釋變量)進行二階最小二乘分析同時繪制出三聚氰胺含量和1 551 cm-1吸光度的散點圖(圖3)，得到復相關系數為0.999 0，ANOVA(方差分析)表格中統計檢定值F為11.456，sig(顯著性)為0.007,說明三聚氰胺含量對吸光度影響顯著(sig小于0.05說明回歸效應顯著，回歸方程成立)，存在回歸關系；系數表格中雖然KBr質量對應sig為0.007，但是對應統計檢定值t(發生幾率)為-3.385，說明溴化鉀質量對三聚氰胺含量和吸光度無影響。

圖3 三聚氰胺標準品原始數據散點圖Fig.3 Scatter plot of original data of melamine standard

應用SPSS進行回歸分析得到回歸標準化預計值和回歸標準化殘差圖如圖4，由圖4可以看出，大部分點殘差在-2～+2，說明回歸方程顯著，但是S3點回歸標準化殘差值在+2～+3，標準化殘差異常，因此應該去除S3進行建立線性模型，以三聚氰胺含量(g/100g)作為橫坐標，以吸光度作為縱坐標進行回歸分析繪制標準曲線(圖5)得y=0.219 7x+0.700 4，R2=0.999 2，檢出限為0.744 2～3.986 1 g/100g。

圖4 三聚氰胺回歸標準化殘差圖Fig.4 Melamine regression standardized residual plot

圖5 三聚氰胺標準品線性擬合圖Fig.5 Melamine standard linear fitting diagram

2.4 奶粉摻尿素模型建立及回歸分析

對尿素在1 628、1 655、3 350、3 418、3 470 cm-1四個特征吸收峰進行定量分析，按照1.2光譜條件進行的紅外光譜分析數據如表2所示，建立回歸方程后比較可得5個峰值線性相關度分別為0.872 1、0.909 2、0.774 9、0.856 7、0.856 5，因此選取1 655 cm-1作為奶粉摻加尿素的特征吸收峰進行定量分析。

表2 尿素特征吸收峰和吸光度Table 2 Characteristic absorption peak and absorbance of urea

由表2可知，三聚氰胺的含量和1 551 cm-1吸光度呈現出一定的正相關關系，關系式如公式(2)所示：

Y=ax+b+c

(2)

式中：Y表示1 551 cm-1吸光度；x表示三聚氰胺的含量；c表示其他因素對吸光度的影響總和，比如KBr的質量、或者奶粉樣品的品種、噪聲對吸收峰的影響等，一般認為他們是相互獨立且服從正態分布的隨機變量。

通過SPSS軟件讀取表1中尿素含量(解釋變量)，1 655 cm-1吸光度(因變量)，KBr質量(工具變量)進行最小二乘分析同時繪制出尿素含量和1 655 cm-1吸光度的散點圖(圖6)，得到復相關系數為0.954，調整后相關系數為0.999 3，ANOVA表格中sig為0.168，統計檢定值F為2.207，說明尿素含量和吸光度呈現線性正相關，表格中溴化鉀質量對應sig為0.68，說明KBr質量對尿素含量無影響。

圖6 尿素標準品原始數據散點圖Fig.6 Scatterplot of raw data for urea reference

應用SPSS進行回歸分析得到回歸標準化預計值和回歸標準化殘差圖如圖7，由圖7可知，大部分點殘差在-2～+2，說明回歸方程顯著，但是N1點標準化殘差值在+2～+3，因此去除N1進行線性擬合建模，以尿素含量(g/100g)為橫坐標，以1 655 cm-1吸光度為縱坐標進行回歸分析繪制標準曲線(圖8)，為y=0.089 5x+0.390 8，R2=0.999 3，由于N1號樣品吸光度異常，故檢出限為0.042 5～1.729 0 g/100 g。

圖7 尿素回歸標準化殘差圖Fig.7 urea regression standardized residual plot

圖8 尿素標準品線性擬合圖Fig.8 A linear fitting diagram of urea standards

2.5 奶粉摻三聚氰胺精密度和準確度實驗

取高效液相色譜法測定摻偽含量為2.018 1 mg/100g樣品1份，按照1.2分析條件進行紅外光譜測定，平行測定3次，再將三聚氰胺摻偽特征峰處吸光度代入各自回歸分析方程中進行測定得出其摻偽含量計算絕對誤差和相對標準，準確度用絕對誤差表示，精密度用相對標準偏差表示[15]，計算結果如表3所示。

表3 三聚氰胺精密度實驗結果Table 3 Precision test results of melamine

2.6 奶粉摻三聚氰胺結果計算及加標回收率

將1.4配制的奶粉摻偽三聚氰胺梯度樣品S1、S2、S3，按照1.2光譜條件進行分析，并將1 551 cm-1吸收峰帶入回歸方程中計算摻偽含量并計算加標回收率，結果如表4所示。

表4 三聚氰胺加標回收率實驗結果Table 4 Experimental results of melamine spiked recovery rate

2.7 奶粉摻三聚氰胺重現性實驗

取含量為2.018 1 g/100g三聚氰胺，在間隔1、3、5天對3個樣品按照1.2紅外光譜條件進行測量，再將三聚氰胺摻偽1 551 cm-1處吸光度代入回歸分析方程中進行測定得出其摻偽濃度計算精密度，結果如表5所示。

表5 三聚氰胺重現性實驗結果Table 5 Reproducibility test results of melamine

2.8 奶粉摻尿素精密度和準確度實驗

取滴定法法測定摻偽含量為1.574 4 g/100g樣品1份，按照1.2分析條件進行紅外光譜測定，平行測定3次，再將其特征峰處吸光度代入回歸分析方程中進行測定得出其摻偽含量并計算準確度和精密度[16]，結果如表6所示。

表6 尿素精密度實驗結果Table 6 Precision test results of urea

2.9 奶粉摻尿素結果計算及加標回收率

將配制的奶粉摻偽尿素梯度樣品按照1.2光譜條件進行分析，并將1 655 cm-1吸收峰帶入回歸方程中計算摻偽濃度并計算加標回收率，結果如表7所示。

表7 尿素加標回收率實驗結果Table 7 Experimental results of urea standard addition recovery rate

2.10 奶粉摻尿素重現性實驗

取尿素含量為1.574 4 g/100g摻偽樣品，在間隔1、3、5 d對樣品按照1.2紅外光譜條件進行測量，再將尿素摻偽1 655 cm-1處吸光度代入尿素回歸分析方程中進行測定得出其摻偽濃度計算精密度，結果如表8所示。

表8 尿素重現性實驗結果Table 8 Results of urea reproducibility experiment

3 結論

通過奶粉和三聚氰胺和尿素紅外光譜圖官能團分析，結合標準濃度梯度的三聚氰胺圖譜確定特征吸收峰，通過SPSS軟件回歸分析和最小二乘法優化處理建立三聚氰胺的標準曲線，為y=0.219 7x+0.700 4，線性相關性為0.999 2，最低檢出限為0.744 2 g/100g，精密度RSD=0.50%，重現性RSD=3.12%，回收率為100.21%。尿素的標準曲線為y=0.089 5x+0.390 8，線性相關性為0.999 3，最低檢出限為0.042 5 g/100g，精密度RSD=1.56%，重現性RSD=3.51%，回收率為99.66%。結果表明，此方法與國標法相比可以很好的用于奶粉中三聚氰胺和尿素的定量分析，實現三聚氰胺和尿素快速無損檢測。