基于實時熒光PCR對肉制品中羊肉的精確定量

金鷺，陳傳君，林華，胡濱*，韓國全*，陳世界，張婧，安微，楊苗

1(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安，625000)2(成都海關(guān)，四川 成都，61000)3(食品安全檢測四川省重點實驗室，四川 成都，61000)

目前肉類摻假問題頻繁發(fā)生，使得肉類食品的安全狀況令人擔(dān)憂[1]。羊肉作為我國傳統(tǒng)肉食品，富含優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、肉質(zhì)鮮美，需求量逐年增加。巨大的羊肉消費市場，高昂的價格給羊肉摻假帶來了豐厚利潤空間。一些不法商家在利益驅(qū)使下用低價肉(如馬肉、豬肉、鴨肉等)摻入冒充羊肉，這不僅損害了消費者的切身利益，更直接影響消費者的健康甚至?xí)婕白诮绦叛龅葐栴}(如在羊肉中摻入豬肉)[2]。因此，為防止羊肉銷售市場上造假行為發(fā)生，對羊肉的真?zhèn)舞b定具有重要意義。

動物品種的鑒定主要是從蛋白質(zhì)(如等電聚焦電泳、酶聯(lián)免疫吸附試驗等)和核酸(DNA分子雜交、聚合酶鏈式反應(yīng)等)兩個方面進行。蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)在生鮮肉類的品種鑒別方面應(yīng)用較為成功，但當(dāng)肉類經(jīng)過烹調(diào)加工后會使肉蛋白質(zhì)變性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)的可靠性較差[3]。而核酸具有比蛋白質(zhì)更高的熱穩(wěn)定性，基因可以從組織中提取，以物種間基因差異為基礎(chǔ)的分子學(xué)鑒定方法成為研究熱點[4]。DNA分子雜交法程序復(fù)雜，成本昂貴，而且對于近緣物種并不能很好分辨。EBBEHOJ等[5]通過添加未標記雜交物種的DNA，可以減少近緣物種探針和DNA序列之間的雜交，但對密切相關(guān)物種如綿羊和山羊之間的分化檢測限僅約為10%，應(yīng)用相對有限。從TARTAGLIA等[6]首先報道了將聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)用于檢測飼料中的牛源性成分至今，PCR技術(shù)經(jīng)過不斷發(fā)展與完善，已從只能單一擴增檢測，發(fā)展到包括實時熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR，rPCR)、多重PCR、微滴式數(shù)字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)等多種PCR技術(shù)的檢測分析，其中rPCR具有較高靈敏性和特異性，已成為肉制品種屬鑒別的常用方法[7]。目前現(xiàn)有國家、行業(yè)標準頒布的動物源性成分檢測方法，均是基于PCR擴增的定性篩選，即只能判定樣品中是否含有某種動物源DNA成分，結(jié)果以陰性或陽性表示，但無法進行精確定量，這也給政府監(jiān)管部門的打假執(zhí)法帶來一定困難[8]。rPCR在羊肉及其制品中動物源性成分的摻假檢測已有一定研究，主要是針對特定的摻假動物成分，如檢測羊肉中豬肉、雞肉、鴨肉、鼠肉等的含量[9]。但對于可能混雜多種其他肉類或尚不明確摻入何種涉假肉類情況下，如果逐個篩查每一種摻假動物性成分，不僅耗時費力，還給rPCR定量檢測帶來困難。因此，建立對羊肉含量直接定量檢測方法，以滿足市場監(jiān)管需求具有廣闊前景。

根據(jù)NOH等[10]和K?PPEL等[11]最近研究報道，肉質(zhì)量與基因拷貝數(shù)之間存在著密切的線性關(guān)系。而近幾年發(fā)展起來的dd PCR方法，是結(jié)合微流控技術(shù)建立在PCR基礎(chǔ)上的新興核酸檢測技術(shù)，不需要建立標準曲線及標準樣本，能夠直接測定出檢測體系中目的基因的拷貝數(shù)[12]。因此，為實現(xiàn)對羊肉的精準定量，本研究嘗試將rPCR與ddPCR相結(jié)合，利用ddPCR建立拷貝數(shù)和羊肉質(zhì)量的函數(shù)關(guān)系，建立基于rPCR檢測肉中羊肉含量的方法，以便為摻假肉類的監(jiān)督管理提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 實驗材料與試劑

實驗樣品：山羊肉、綿羊肉、鴨肉、水牛肉、黃牛肉、牦牛肉、豬肉、狐貍?cè)狻Ⅴ跞狻⒙谷狻⑼萌狻㈦u肉、鴿肉、火雞肉、鵝肉、鱈魚、虹鱒魚、銀鱈魚、大黃魚、大菱鲆等，均由成都海關(guān)技術(shù)中心提供。

引物探針(羊源性引物探針)，由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成；質(zhì)粒(pUC57-GH-羊)，由北京六合華大基因科技有限公司合成；Droplet Generator DG8 CartndgeDroplet Gene rator，BIO-RAD公司；DG8 GasketPierceable Foil Heat Seal，BIO-RAD公司；Premix Ex Taq(Probe qPCR)預(yù)混液，TaKaRa公司；蛋白酶K(20 mg/mL)，拓樣生物有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒Plasmid Mini Kit，QIAGEN生物科技有限公司；ddPCR Supermix for Probes (no Dutp)、ddPCR Droplet Generation Oil、ddPCR Droplet Reader Oil，BIO-RAD有限公司；

1.1.2 儀器與設(shè)備

FastPrep型樣品研磨器，印度MP有限公司；X3R型高速冷凍離心機，美國Thermo Fisher Scientific公司；FastPrep-24 5G型勻漿儀，美國MP Biomedicals生物醫(yī)學(xué)公司；ND-1000 NanoDrop型核酸蛋白測定儀、CFX96 Real-time PCR 儀、QX100 Droplet Digital PCR系統(tǒng)(微滴生成儀PX1PCR板熱封儀微滴分析儀)，美國BIO-RAD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品DNA的制備

將新鮮羊肉的肌肉組織絞碎后于100 ℃烘干至恒重，再向研缽中加入液氮，將烘干樣品研磨至粉狀。稱取處理后的羊肉粉100 mg，采用實驗室自制的動物組織基因組磁珠法提取試劑盒進行DNA提取，所得基因組DNA質(zhì)量通過瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop ND-2000核酸蛋白定量儀評價[13]。

1.2.2 羊源性引物探針篩選設(shè)計與條件優(yōu)化

1.2.2.1 引物探針選擇與設(shè)計

通過查詢NCBI數(shù)據(jù)庫，選定羊的單拷貝生長激素基因GH(序列號為NC-019468)設(shè)計引物探針，設(shè)計的引物探針由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進行合成。

1.2.2.2 特異性驗證

為了對所設(shè)計引物進行特異性驗證，采用磁珠法分別提取1.1.1中所述的山羊肉、綿羊肉等20種動物肌肉DNA。同時設(shè)置用ddH2O代替核酸的陰性對照(NTC)。若陰性對照結(jié)果為陰性，整個試驗有效，可進一步判定結(jié)果。實驗重復(fù)3次，每次2個平行。

1.2.2.3 rPCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

采用TaqMan PCR Master Mix(Bio-Rad)試劑推薦的25 μL體系，對模板DNA(約50 ng/μL)進行rPCR擴增。反應(yīng)體系為：Dream Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，用ddH2O補足25 μL。擴增條件確定為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，45個循環(huán)。通過比較rPCR的Ct值和擴增曲線等來確定優(yōu)化結(jié)果。每個樣品每個處理做2個平行。

退火溫度優(yōu)化：設(shè)置退火溫度為58、59、60、61、62、63、64和65 ℃共8個梯度，通過比較分析rPCR的Ct值和擴增曲線等來確定羊源性特異性引物和探針的最佳退火溫度。每個樣品每個處理做2個平行。

引物濃度優(yōu)化：設(shè)置rPCR體系中上下游引物濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1 pmol/μL，Dream Taq PCR Master Mix 12.5 μL，探針濃度0.4 pmol/μL 加1 μL，DNA模板2 μL，用ddH2O補足至25 μL。擴增條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，45個循環(huán)。通過比較分析rPCR的Ct值和擴增曲線等來確定優(yōu)化結(jié)果。每個樣品每個處理做3個平行。

探針濃度優(yōu)化：設(shè)置rPCR體系中探針濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1 pmol/μL，Dream Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物(濃度0.4 pmol/μL)各1 μL，DNA模板2 μL，用ddH2O補足25 μL。擴增條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，45個循環(huán)。通過比較分析rPCR的Ct值和擴增曲線等來確定優(yōu)化的結(jié)果。每個樣品每個處理做3個平行。

1.2.2.4 靈敏度驗證

為了驗證該方法的靈敏度，將提取的羊的DNA模板按梯度分別稀釋為100、10、1、0.1、0.01、0.001 ng/μL，進行qPCR擴增，實驗重復(fù)3次，每個梯度2個平行。

1.2.3 rPCR定量檢測方法的建立

1.2.3.1 質(zhì)粒的合成與DNA提取

根據(jù)設(shè)計羊源性引物探針所選取的保守區(qū)域合成質(zhì)粒pUC57-GH-羊，委托北京六合華大基因科技有限公司合成。質(zhì)粒的制備按照劉麒等[14]的方法進行，質(zhì)粒DNA采用小量抽提試劑盒提取。

1.2.3.2 基于拷貝數(shù)的羊肉質(zhì)量與Ct值函數(shù)關(guān)系的建立

(1)質(zhì)粒拷貝數(shù)與Ct值函數(shù)關(guān)系的建立

用核酸蛋白儀測定提取的pUC57-GH-羊標準質(zhì)粒DNA質(zhì)量濃度，并對質(zhì)粒DNA進行10倍稀釋，采用qPCR進行擴增，以lg(重組質(zhì)粒拷貝數(shù))為橫坐標，對應(yīng)Ct值為縱坐標生成標準曲線，其中重組質(zhì)粒標準品拷貝數(shù)按公式(1)計算[15]：

(1)

式中:樣本質(zhì)量濃度為測定的質(zhì)粒含量(ng/μL)，經(jīng)核酸蛋白檢測儀測定后，羊質(zhì)粒質(zhì)量濃度為240.69 ng/μL；樣本分子質(zhì)量=重組質(zhì)粒長度×660，其中重組質(zhì)粒長度按公式(2)計算：

重組質(zhì)粒長度=T載體長度+目的片段長度

(2)

式中:T載體長度為2 710 bp，目的片段長度為300 bp。

(2)羊肉質(zhì)量與拷貝數(shù)函數(shù)關(guān)系的建立

將羊肉與豬、鴨肉的干物質(zhì)(總干物質(zhì)100 mg)按一定比例混合后，準確稱取7 mg干物質(zhì)提取DNA，提取的DNA進行ddPCR擴增，讀取羊肉基因拷貝數(shù)。以羊肉質(zhì)量為y軸，質(zhì)量對應(yīng)的拷貝數(shù)為x軸建立羊肉質(zhì)量與基因拷貝數(shù)的函數(shù)關(guān)系。實驗重復(fù)3次，每次2個平行。具體混合比例如表1所示。

1.2.4 rPCR檢測方法靈敏度驗證

為了驗證該方法的實際檢測靈敏度，將羊肉干物質(zhì)與牛肉、鴨肉、豬肉干物質(zhì)進行混合。實驗重復(fù)2次，每次2個平行。具體混合比例如表2所示。

表1 混合肉樣中的樣品混合比例Table 1 Mixing ratio of samples in mixed meat samples

注：-表示不含有(下同)

表2 rPCR檢測方法實際靈敏度實驗的樣品混合比例Table 2 rPCR detection method sample mixing ratio of actual sensitivity experiment

1.2.5 rPCR檢測方法定量線性范圍的確定

為確定rPCR定量方法線性范圍，將羊肉干物質(zhì)與豬、鴨肉干物質(zhì)混合(總干物質(zhì)10 g)，以模擬摻假樣品的檢測。按照2.2所優(yōu)化的最佳反應(yīng)條件進行rPCR擴增。每個比例平行檢測3次，通過2.3中得到的函數(shù)關(guān)系公式計算其含量并與實際樣品含量比較，計算平行組內(nèi)的平均值、相對標準偏差和相對誤差，對檢測體系的定量準確性進行驗證。具體混合比例如表3所示。

表3 rPCR模擬樣品混合比例Table 3 rPCR simulated sample mixing ratio

1.2.6 市售羊肉樣品含量的檢測

為了驗證本方法在實際羊肉樣品檢測中的可行性，對2018～2019年成都海關(guān)技術(shù)中心保存的四川省內(nèi)超市和農(nóng)貿(mào)市場隨機抽取的28個羊肉及其制品進行檢測。準確稱取經(jīng)前處理干燥后的1 g待檢樣品，加入100 mg的內(nèi)標干物質(zhì)混合均勻后，取7 mg進行DNA提取，采用現(xiàn)行定性檢測標準SN/T 2051—2008食品、化妝品和飼料中牛羊源性成分檢測方法進行定性檢測，檢測結(jié)果顯示為陽性的樣品再利用本實驗建立方法進行定量檢測，進一步驗證所建方法的準確性和實際應(yīng)用能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊源性引物探針的篩選與設(shè)計

2.1.1 單拷貝基因的篩選

GH基因在整個基因組里僅在19號染色體上有1個拷貝，是單拷貝基因。

2.1.2 引物探針的設(shè)計

2.1.2.1 序列的篩選

利用序列分析軟件DNA Man 6.0 對山羊、綿羊、水牛、黃牛、瘤牛的生長激素基因序列進行比對分析，各物種序列比對結(jié)果如圖1所示，通過選取羊的特異性保守區(qū)域進行引物探針的設(shè)計。

2.2.1.2 引物探針的設(shè)計

設(shè)計的羊源性引物探針基本信息如表4所示。

表4 羊源性引物探針基本信息Table 4 Basic information of sheep primers probe

表5為設(shè)計的羊源性GH基因引物探針的序列。合成的引物進行PCR擴增后進一步瓊脂糖凝膠電泳檢測，最后對產(chǎn)物進行測序，測序結(jié)果進行Blast同源性數(shù)據(jù)庫比對后結(jié)果顯示同源性均在96%以上。

圖1 羊與其他物種GH基因序列比對Fig.1 Comparison of GH gene sequences between sheep and other species注：左側(cè)序列號從上到下依次為山羊、綿羊、水牛、黃牛、瘤牛

2.1.3 特異性驗證

由圖2可知，在引物特異性實驗中，只有綿羊和山羊的DNA檢測到了擴增信號，平均Ct值分別為24.93和25.77，未出現(xiàn)非特異性擴增；而水牛、黃牛、牦牛、豬、鹿、狐貍、鵝、兔、鴿、鱈魚、大黃魚、鴨、火雞、虹鱒魚、貂、雞、銀鱈魚、多寶魚等非目標物種DNA的PCR試驗未出現(xiàn)擴增曲線，說明本試驗所設(shè)計引物特異性良好且能同時對綿羊和山羊成分進行檢測。

圖2 羊源性引物探針rPCR特異性驗證Fig.2 rPCR specificity verification of sheep primers

2.1.4 反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.1.4.1 rPCR最佳退火溫度

由圖3可知，將反應(yīng)的退火溫度作為單一變量，當(dāng)退火溫度為60 ℃時，熒光信號強度最強，Ct值為23.01，因此羊源性引物探針rPCR的最佳退火溫度為60 ℃。

圖3 羊源性引物探針rPCR退火溫度優(yōu)化Fig.3 rPCR annealing temperature optimization of sheep primers

2.1.4.2 rPCR最佳引物和探針濃度

當(dāng)rPCR擴增體系中引物終濃度為0.2 pmol/μL時熒光信號最強，Ct值平均值最小為23.286。因此，0.2 pmol/μL為rPCR檢測羊源性成分的最佳引物濃度。當(dāng)rPCR擴增體系中探針終濃度為0.6 pmol/μL時熒光信號最強，Ct值平均值最小為23.07，因此0.6 pmol/μL為rPCR檢測羊源性成分的最佳探針濃度。

2.1.5 靈敏度驗證

由圖4可看出，當(dāng)DNA質(zhì)量濃度為0.001 ng/μL時，未發(fā)生擴增反應(yīng)，而當(dāng)DNA質(zhì)量濃度為0.01 ng/μL時有擴增，Ct值為38.08。因此，在本實驗所建立的方法下，該對引物在rPCR反應(yīng)體系中檢測羊DNA的檢測限為0.01 ng/μL，體系總DNA為0.02 ng。

圖4 rPCR檢測羊肉DNA的靈敏度驗證Fig.4 Sensitivity verification of rPCR for detection of mutton DNA

2.2 rPCR定量檢測方法的建立

2.2.1 羊GH基因標準品質(zhì)粒DNA合成序列與提取結(jié)果

2.2.1.1 質(zhì)粒合成序列

選擇用于設(shè)計引物的單拷貝基因保守區(qū)域作為質(zhì)粒的合成序列，具體序列如下：

481 cagccatgtc cttgtccggc ctgtttgcca acgctgtgct ccgggctcag cacctgcatc

541 aactggctgc tgacaccttc aaagagtttg taagctcccc agagatgtgt cctagaggtg

601 gggaggcagg aaggggtgaa tccgcacccc ctccacacaa tggga-gggaa ctgaggacct

661 cagtggtatt ttatccaagt aaggatgtgg tcaggggagt ggaaatgggg gtgtgtgggg

721 tggggagggt tccgaataag gcagtgaggg gaaccccgca ccagctgaga cctgggtggg

781 tgtgttctcc ccccaggagc gcacctacat cccggaggga cagagatact ccatccagaa

2.2.1.2 羊GH基因標準品質(zhì)粒DNA的提取質(zhì)量

質(zhì)粒DNA提取的結(jié)果如表6所示，提取的pUC57-GH-羊質(zhì)粒DNA純度A260/A280均在1.8以上，提取的DNA質(zhì)量濃度平均值為240.26 ng/μL，說明提取的質(zhì)粒DNA純度較好，滿足定量檢測的要求。

表6 羊GH基因標準品質(zhì)粒DNA提取質(zhì)量Table 6 Sheep GH gene standard plasmid DNA extraction quality

2.2.2 羊肉質(zhì)量與Ct值函數(shù)關(guān)系的建立

2.2.2.1 Ct值與拷貝數(shù)的函數(shù)關(guān)系

將經(jīng)活化的質(zhì)粒提取DNA，通過10倍稀釋后進行rPCR擴增，用核酸蛋白儀對DNA的質(zhì)量測定，得到羊的質(zhì)粒質(zhì)量濃度為240.26 ng/μL。通過拷貝數(shù)計算公式得總拷貝數(shù)為：7.27×1010。以lg(重組質(zhì)粒樣品稀釋度)為橫坐標，以對應(yīng)的Ct值為縱坐標作圖得到，羊質(zhì)粒Ct值和拷貝數(shù)線性關(guān)系為y=-3.417 7x+72.797，所建標準曲線相關(guān)系數(shù)(R2)為0.996 4(圖5)，這表明其線性關(guān)系好，可用于準確定量。

圖5 羊肉標準質(zhì)粒的拷貝數(shù)與Ct值函數(shù)關(guān)系Fig.5 The relationship between the copy number of mutton standard plasmid and Ct value

2.2.2.2 羊肉質(zhì)量與拷貝數(shù)的函數(shù)關(guān)系

以羊肉質(zhì)量為y軸，質(zhì)量對應(yīng)的拷貝數(shù)為x軸建立函數(shù)關(guān)系。由圖6可知，線性方程為y=0.003x+0.097 8，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 4，這表明羊肉的質(zhì)量與基因拷貝數(shù)之間有明顯的線性關(guān)系。

圖6 羊肉質(zhì)量與拷貝數(shù)函數(shù)關(guān)系Fig.6 Sheep quality and copies number function

2.2.2.3 Ct值與羊肉質(zhì)量的函數(shù)關(guān)系

根據(jù)2.2.2.1中拷貝數(shù)與Ct值的函數(shù)關(guān)系y=-3.417 7x+ 72.797，以及2.2.2.2中羊肉質(zhì)量與拷貝數(shù)的函數(shù)關(guān)系y=0.003x+0.097 8相結(jié)合，以基因拷貝數(shù)為中間轉(zhuǎn)化關(guān)系，可以由樣品rPCR擴增的Ct值計算出樣品質(zhì)量。得出羊肉的質(zhì)量與Ct值之間的關(guān)系如公式(3)所示：

(3)

式中:Mb表示基于基因拷貝數(shù)為中間值換算羊肉的質(zhì)量，A表示羊源性成分擴增的Ct值。

2.3 檢測方法靈敏度驗證

由圖7可知，當(dāng)羊肉含量為0.25%時，Ct值大于40，視為陰性。即該檢測方法實際靈敏度為0.25%，并且隨著羊肉比例增加，Ct 值逐漸減小。

圖7 rPCR定量方法靈敏度驗證Fig.7 rPCR quantitative method sensitivity verification

2.4 rPCR的定量線性范圍及準確性驗證

由表7可知，羊肉含量為1%的模擬摻假樣品相對標準偏差(RSD)大于25%，不符合國際食品法典委員會關(guān)于食品定性和定量檢測方法標準中最低定量檢測限RSD應(yīng)小于25%的規(guī)定[16]。而其余含羊肉5%～70%的模擬摻假樣品RSD值均在14%以內(nèi)，滿足定量檢測要求，所以該方法在羊肉含量為5%以上時的準確度和精密度高，因此方法的最低定量檢測限為5%。

表7 rPCR定量方法的重復(fù)性和準確性驗證結(jié)果Table 7 Repeatability and accuracy verification results of rPCR absolute quantification method

2.5 市售羊肉樣品含量的檢測結(jié)果

將本實驗建立的定量檢測方法和現(xiàn)行檢測方法(SN/T 2051—2008)對樣品中羊肉含量進行檢測，結(jié)果如表8所示。

表8 rPCR對市售羊肉樣品的檢測結(jié)果Table 8 Detection of mutton samples by rPCR

由表8可知，由于現(xiàn)行食品中羊肉含量檢測方法(SN/T 2051—2008)僅能夠檢測出食品中是否含有羊肉成分，但并不能確定羊肉的具體含量。因此，需要進行進一步的檢測才能確定其含量。由本實驗建立的檢測方法可知，來源于農(nóng)貿(mào)市場的3個樣品的羊肉含量不足100%，其中2個樣品中羊肉含量分別是94.8%和93.5%，這并不能簡單判定為摻假，因為摻假的目的是獲取更大利潤，摻入非羊肉比例太低則無利可圖；而且食品在生產(chǎn)加工、流通過程中，不同原料或產(chǎn)品間均存在著交叉污染的可能。因此，綜合判定這2個樣品可能是加工或流通過程中被其他動物源成分無意污染，而非故意添加。另外一個樣品中羊肉所占比例僅為58.5%，可確定為摻假，這表明現(xiàn)有的市售樣品存在一定的摻假情況。

3 討論

為實現(xiàn)rPCR方法檢測的可靠性和取樣可比性，本研究首先對樣品進行干燥處理，以保證檢測同種肉樣間樣品細胞密度趨于一致。rPCR方法應(yīng)用于肉制品的摻假檢驗過程中，物種特異基因的正確選擇是實現(xiàn)物種鑒定的關(guān)鍵因素。現(xiàn)有鑒定方法多數(shù)將研究的基因位點選擇在線粒體DNA(mt DNA)上，但THALMANN等[17]認為mt DNA片段可以整合到基因組中，由于進化效率不同，這些整合后的基因可能會和mt DNA同時擴增，對結(jié)果分析造成干擾。MURUGAIAH等[18]認為由于不同物種細胞中線粒體的拷貝數(shù)各不相同，以線粒體為靶基因的檢測結(jié)果很難定量分析出食品中動物源性成份的組成比例。FLOREN等[19]研究也表明以線粒體DNA為目標進行物種量化是并不適宜，因為組織中每個細胞mt DNA含量存在至少5倍的差異，這會導(dǎo)致物種DNA含量被低估或高估。與線粒體基因相比，持家基因?qū)儆趩慰截惢颍哂锌截悢?shù)少且數(shù)量相對恒定等特點，不會因為取樣部位不同導(dǎo)致定量結(jié)果出現(xiàn)偏差，更有利于做定量分析。REN等[20]利用單拷貝基因設(shè)計特異性引物，定量檢測了食品中牛、豬等動物源性成份，取得了理想效果。因此，為了定量準確性，本文選擇單拷貝持家基因生長激素(GH)基因作為靶基因來設(shè)計引物。

此外，對于深加工的肉制品，DNA受到加熱影響后容易發(fā)生斷裂，無法進行PCR的有效擴增[21]。EBBEHOJ等[22]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)肉溫加熱到100 ℃時DNA片段減少到1 100 bp 左右，而加熱到120 ℃時減少至 600 bp 以下。MARTN等[23]在采用rPCR檢測食品和飼料中豬源性成分時也認為，肉類經(jīng)過加工后DNA片段會變短，在利用PCR技術(shù)進行動物源性成分檢測時，引物擴增片段要求盡可能較短。本研究中設(shè)計的引物擴增片段長度為83 bp，滿足熱加工肉制品的分析要求。因此，本研究對18個常見非目標物種DNA進行擴增檢測，結(jié)果表明引物與探針僅對綿羊和山羊的DNA特異，這降低了其在實際應(yīng)用中出現(xiàn)非特異性擴增風(fēng)險。

在肉類定量檢測中，如何有效得到待檢肉類的質(zhì)量百分比值是研究難點，建立線性回歸標準曲線法是目前實現(xiàn)定量檢測的有效方法。CAI等[24]利用ddPCR方法檢測肉制品中豬肉和雞肉質(zhì)量時，發(fā)現(xiàn)肉質(zhì)量與DNA質(zhì)量以及DNA質(zhì)量和DNA拷貝數(shù)之間呈線性關(guān)系，能夠通過DNA拷貝數(shù)建立計算生肉質(zhì)量的公式。因此，本研究以羊肉為檢測對象，借助ddPCR技術(shù)，構(gòu)建了拷貝數(shù)與羊質(zhì)粒的Ct值、拷貝數(shù)與羊肉含量之間的函數(shù)關(guān)系，以基因拷貝數(shù)為中間轉(zhuǎn)化關(guān)系，最終構(gòu)建Ct值與羊肉含量的函數(shù)關(guān)系。此外，在rPCR的定量研究中，判定Ct值的檢測閾值沒有統(tǒng)一標準，需根據(jù)不同樣品、目的基因及引物探針的特異性來綜合分析并制定檢測閾值[25]。本試驗根據(jù)樣品中羊肉含量為0.25%時Ct值大于40，將Ct值40作為檢測閾值，即該檢測方法實際靈敏度為0.25%。

為了驗證本方法實際的應(yīng)用能力，將本方法與SN/T 2051—2008食品、化妝品和飼料中牛羊源性成分檢測方法對比檢測市售樣品。結(jié)果表明本方法能夠?qū)悠分?%以上的羊肉進行精準定量，而且不需要每一次檢測都構(gòu)建標準曲線，方法具有較好重復(fù)性和穩(wěn)定性。對于待檢樣品，僅需要測定羊源性成分的Ct值就可通過公式得到羊肉含量。

4 結(jié)論

本研究將rPCR與ddPCR相結(jié)合，建立了基于DNA拷貝數(shù)與樣品質(zhì)量間線性關(guān)系對羊肉含量進行定量的方法。通過對通過模擬摻假樣品和市售樣品進行檢測，本方法能夠?qū)悠分?%以上的羊肉進行精準定量，具有良好的準確性和穩(wěn)定性，能夠為羊肉的摻假鑒別提供參考。