“美早”甜櫻桃褐腐病病原菌的分離及內生拮抗細菌的篩選鑒定

郗良卿，張士凱，陳雨詩，周一寧，張啟月，辛力，張倩*，吳澎*

1(山東農業大學，山東 泰安，271000) 2(山東省果樹研究所，山東 泰安，271000)

甜櫻桃又名大櫻桃，是薔薇科、李屬、櫻桃亞屬植物，多產于歐洲與亞洲，19世紀70年代從歐洲傳入中國[1-2]。甜櫻桃可直接食用，也可經過干燥、腌制加工成果醬、水果汁以及罐頭等食品。甜櫻桃含鐵豐富(8mg/100g)，約為蘋果、梨的20～30倍[3]；還富含多種酚類化合物，如羥基肉桂酸、原花青素、黃酮醛及花青素等，具有較強的抗氧化能力[4]，在預防疾病與人體健康方面起著至關重要的作用[5]。

甜櫻桃果實在貯藏過程中易發生失水、軟化、褐變及病原真菌侵蝕腐敗的現象，導致果實腐爛，其真菌性病原微生物的侵染是造成果實采后腐爛的主要原因，引起的腐爛損失可達總損失50%以上[6]。目前國內甜櫻桃主要采后病害有青霉病、灰霉病、根腐病、褐腐病、黑腐病和黑斑病等[7-8]，導致其病害的真菌性病原菌有擴展青霉菌(Penicilliumexpansum)[9]、美澳型核果褐腐病菌(Moniliniafructicola)[10]、葡萄孢霉菌(Botrytiscinerea)、根霉菌(Rhizopussp.)[11]、毛霉菌(Mucorsp.)[12]、鏈格孢霉(Alternariaalternata)及炭疽菌(Colletotrichumsp.)[13]、黑曲霉(Aspergillusniger)等[14-15]。

“美早”甜櫻桃果個大、肉硬、色澤鮮麗，無畸形果，品質優，種植面積廣且產量大[16]，是山東泰安地區甜櫻桃主要品種，其褐腐病引起的果實腐敗造成了嚴重的經濟損失，是政府和果農亟待要求解決的重要問題。國內報道的甜櫻桃褐腐病是由真菌鏈核盤菌屬(Moniliniaspp.)侵染所導致的，主要分為3個種：核果鏈核盤菌[Monilinialaxa(Aderh. et Ruhl.) Honey]、美澳型核果褐腐病菌[M.fructicola(Wint.)Honey][10]和果生鏈核盤菌[M.fructigena(Aderh. et Ruhl.) Honey][17]。目前山東泰安地區尚未明確“美早”甜櫻桃褐腐病的優勢致病菌及其防治措施，因此確定“美早”甜櫻桃褐腐病優勢致病菌并進行分離鑒定，在此基礎上有針對性地篩選內生拮抗菌，明確甜櫻桃褐腐病的生物防治方法，對減少果農損失、有效制定防治工作具有重要意義。

甜櫻桃采后防腐保鮮的方法主要分為物理保鮮和化學保鮮法[18]。物理保鮮(低溫、CA、輻照、熱處理)具有成本高，保鮮期短等缺點；化學保鮮劑(CaCl2、ClO2、1-MCP、植物精油)作為一種常用的保鮮手段，雖然效果較為理想，但長期使用會導致病原菌產生抗藥性，且存在一定的食品安全隱患[19]。因此相對低成本、安全健康、對環境友好的微生物拮抗保鮮法成為當下研究熱點[20]。在甜櫻桃采后保鮮的拮抗微生物中，國內已報道的主要有羅倫隱球酵母(Cryptococcuslaurentii)[21]、芽孢桿菌屬(Bacillusspp.)[22-23]等外源拮抗菌株，而尚未查閱到甜櫻桃內生拮抗菌株報道。

本文明確鑒定了導致山東泰安地區“美早”甜櫻桃褐腐病的主要病原菌，從健康甜櫻桃本身分離篩選得到內生拮抗菌株，不僅能夠解決當前面臨的“美早”鮮果腐爛問題，還可為其他品種甜櫻桃采后防腐保鮮技術提供新思路和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甜櫻桃為山東省果樹研究所天平湖基地(泰安)采集的“美早”甜櫻桃。

λDNA(TIANGEN Lot.L0525)、DL2000(TAKARA Lot.A2201A)、6×Loading buffer(TAKARA Lot.A7301A)、50×TAE(CWBIO Lot.10142)、2×Es Taq MasterMix等，均由北京索萊寶科技有限公司提供。

1.2 儀器與設備

303-00A型電熱恒溫恒濕生化培養箱，天津賽得利斯實驗分儀器制造廠；XFC-100CA型高壓蒸汽滅菌鍋，浙江新豐醫療器械有限公司；XSP-63A型熒光顯微鏡，上海光學儀器一廠；電泳儀，北京市六一儀器有限公司；PCR儀，德國Biometra公司；ChamlGel6000型全自動凝膠成像分析系統，北京賽智創業科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 病原菌的分離鑒定與致病性驗證

1.3.1.1 病原菌的分離純化

將腐敗“美早”甜櫻桃樣品先用75%(體積分數)醫用酒精進行表面消毒，再用無菌水清洗表面3次，自然風干，用無菌刀片和鑷子切取少量腐敗果實組織，將其置于抗性(鏈霉素、青霉素)PDA培養基中央， 28 ℃恒溫恒濕生化培養箱培養3～4 d。待平板菌落長出后，挑取菌落邊緣菌塊置于另一PDA培養基，28 ℃培養，多次純化，直至單一菌落為止。將單一菌落接種于試管斜面，于4 ℃冰箱中保藏備用。以上操作均在無菌環境下進行。

1.3.1.2 病原菌致病性檢測

根據柯赫氏法則[24-26]驗證，將分離純化的單一菌落置于PDB試管中，28 ℃、180 r/min培養48 h，制成濃度為1×106CFU/mL菌懸液。取健康表面無任何損傷的“美早”甜櫻桃，用75%醫用酒精浸泡20 s，再用無菌水清洗3次，自然晾干，用無菌牙簽在果實赤道部位刺3 mm×3 mm×3 mm的傷口一處，吸取10μL 1×106CFU/mL菌懸液置于傷口處，待果實自然吸取完后將果實放于密封袋中，28 ℃恒溫培養3 d，重復3次，觀察發病程度。將發病明顯的果實進行病原菌的分離鑒定，判斷與所接種的菌株形態是否一致。

其中，果實根據腐爛程度可分為5個等級[27]，分級標準如表1所示。

表1 果實發病級別Table 1 Fruit morbidity grade

1.3.1.3 病原菌形態學觀察

將分離純化的病原菌放于PDA培養基，28 ℃培養3～5 d，進行菌落形態觀察。

將無菌蓋玻片以∠45°插入PDA培養基中央，挑取單一菌落置于蓋玻片與PDA培養基的交界處，28 ℃培養3～7 d，將蓋玻片取出，用酒精棉球輕輕擦拭蓋玻片另一面，將菌絲生長旺盛的一面與滴有1滴乳酸酚棉藍染液的載玻片接觸，在顯微鏡下觀察菌絲體和孢子生長情況[28]。

1.3.1.4 病原菌生物學鑒定

將單一菌落接種至PDB培養基中， 28 ℃、150 r/min培養48 h，制成菌懸液。挑取100 mg菌絲球液氮研磨3次，按照真菌基因組試劑盒法提取DNA。將提取的DNA置于-20 ℃保藏備用。

本試驗采用真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGAT-ATGC-3′),均由華大基因科技有限公司合成。PCR擴增體系為25 μL，如表2所示。PCR反應條件由表3可知，其中變性、退火和延伸3個步驟共30個循環，最后4 ℃保存。

表2 PCR反應體系Table 2 PCR reaction system

表3 PCR反應條件Table 3 PCR reaction conditions

PCR擴增產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳、Goldview Ⅱ染色，用凝膠成像系統觀察條帶并記錄結果。PCR產物由睿博興科生物技術有限公司純化后測序。將測序結果在NCBI網站上進行Blast比對，在GenBank數據庫中同源性比較，選擇同源性較高的菌株序列，利用MEGA 7.0軟件構建系統發育樹。

1.3.2 內生拮抗細菌的分離、篩選與鑒定

1.3.2.1 內生細菌的分離純化

取30顆健康“美早”甜櫻桃整果研磨，稱取1 g果肉加入9 mL無菌生理鹽水中，混勻配成原液，靜置20 min。采用梯度稀釋法將去稀釋成10-3、10-4、10-5的濃度稀釋液，分別取100 μL涂布于LB培養基中，每個梯度設3個平行， 37 ℃恒溫恒濕培養24 h。

將生長出的菌落接種至另一LB培養基上進行三區劃線，37 ℃培養，直至長出單菌落。將單菌落挑取至LB斜面，待菌落長出后置于4 ℃保藏。

1.3.2.2 內生拮抗細菌的篩選

采用濾紙片法，在培養病原菌7～10 d的PDA平板上取6 mm菌餅，將其接種于另一PDA平板中央，將6 mm無菌濾紙片置于距病原菌2.5 cm處，吸取6 μL內生細菌發酵液打在濾紙片上，每個板3個平行，以僅接種病原菌的平板作為對照，重復3次，28 ℃恒溫培養5～7 d，觀察菌落直徑及抑制率[29]。抑制率的計算如公式(1)所示：

抑制率/%=

(1)

1.3.2.3 內生拮抗細菌形態鑒定及生理生化指標鑒定

將分離純化的內生拮抗細菌置于LB培養基，37 ℃恒溫培養24 h，進行菌落形態觀察，并對菌株進行革蘭氏染色在油鏡下觀察菌落的形態特征。

內生拮抗細菌的生理生化特征鑒定具體方法參照《常見細菌系統鑒定手冊》[30]和《伯杰細菌鑒定手冊》[31]。

1.3.2.4 菌株X-16的rDNA序列分析

采用細菌基因組提取試劑盒法提取X-16基因組DNA，利用細菌通用引物27F(5′- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和 1 492r (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進行 PCR 擴增，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR 產物，并對其進行測序。序列在 GenBank上進行序列 Blast比對，選擇具有代表性的菌株序列，利用MEGA 7.0軟件進行聚類分析構建系統發育樹。

1.3.3 拮抗菌X-16不同處理液對病原菌的拮抗效果

1.3.3.1 拮抗菌X-16生長曲線的測定

將菌株X-16活化，按2%接種量分別接種于 NB培養基中， 37 ℃、150 r/min 恒溫振蕩培養，分別于0、2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 18、 20、 24和26 h取樣，以未接種的空白 NB 培養基作為對照，利用紫外分光光度計測定其600 nm處的吸光度，重復3次，每次3個平行，繪制出菌株的生長曲線。

1.3.3.2 拮抗菌菌懸液對病原菌的拮抗作用

將培養到平穩期的拮抗菌液制成濃度為1×108CFU/mL菌懸液，按照1.3.2.2中的方法進行抑制率的測定。

1.3.3.3 拮抗菌發酵液和發酵上清液對病原菌的拮抗作用

將活化的菌株X-16按2%接種量接種于 NB培養基中， 37 ℃、150 r/min 恒溫振蕩培養72 h，12 000 r/min離心2 min，過0.22 μm濾膜得發酵上清液。將培養72 h的發酵液稀釋至濃度1×108CFU/mL，按照1.3.2.2中的方法進行抑制率的測定。

1.4 數據處理

試驗數據用Excel與Origin軟件進行計算作圖，SPSS軟件進行方差分析和顯著性分析。試驗結果以平均值(mean)±標準差(SD)表示。

2 結果與分析

2.1 病原菌鑒定

2.1.1 菌落形態

將分離純化的病原菌置于PDA培養基，28 ℃恒溫培養4 d。通過菌落形態觀察發現，菌落在PDA平板上大致呈圓形，輪紋狀，顏色為灰白色，菌落相對平坦，質地絨毛狀或絮狀，在菌落邊緣形成一圈濃密白色絨毛，邊緣輪廓清晰；有菌絲，菌絲無色，邊緣整齊；有孢子。

2.1.2 顯微形態分析

將病原菌在顯微鏡下進行顯微觀察發現，其菌絲壁薄、光滑、致密，呈樹枝狀，多個分支，分支狹窄；分生孢子芽生，鏈狀排列，橢圓形或卵形；分生孢子梗較短，分枝。

2.1.3 ITS序列測定與構建進化樹

將病原菌株標號為HF菌株，利用 ITS通用引物進行 PCR 擴增，并對純化的PCR產物進行測序，獲得了580 bp左右的序列，如圖1所示。

將測序結果進行同源性比較和構建系統發育樹后發現：病原真菌HF序列在 GenBank 中和Moniliniafructicola有比較高的同源性。從GenBank 數據庫中選取代表葡萄孢屬不同種的 ITS序列，以核果鏈核盤菌Monilinialaxa(LT615188.1)、桃褐腐病菌Moniliniafructicola(KM279616.1)與核盤菌Sclerotiniasclerotiorum(MK010971.1)作為外群，構建系統發育樹，結果表明，HF菌株與親緣關系較近的Moniliniafructicola聚于同一支，同源性達到99%(如圖2所示)；結合其形態學培養特征，將病原真菌HF鑒定為美澳型核果褐腐病菌(Moniliniafructicola)。

圖1 PCR 擴增產物凝膠電泳結果Fig.1 Electrophoresis analysis of PCR amplified products

圖2 基于菌株HF的ITS基因序列構建的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree constructed based on the sequence of ITS gene of strain HF

2.1.4 致病性驗證

將分離的美澳型核果褐腐病菌(Moniliniafructicola)回接于健康甜櫻桃進行致病性實驗。結果表明，回接后的甜櫻桃果實出現軟化，病斑直徑逐漸增大，有白色菌絲，直至完全腐敗。如圖3所示，接種的甜櫻桃果實24 h后出現軟化，72 h后有明顯病斑，120 h后每個果實基本都出現不同程度的病狀，發病率100%，發病級別最高達4級，發病癥狀與自然條件下發病癥狀相一致，由此證明美澳型核果褐腐病菌(Moniliniafructicola)是造成山東省泰安市“美早”甜櫻桃采后褐腐病的病原菌。

a-24 h櫻桃發病情況;b-72 h櫻桃發病情況;c-120 h櫻桃發病情況圖3 櫻桃發病情況Fig.3 Cherry incidence

2.2 內生拮抗細菌的篩選、鑒定

2.2.1 內生拮抗細菌的分離與篩選

從健康甜櫻桃果實上獲得有形態差異的細菌19株，菌株編號X-1～X-19。從19株菌株中篩選得到5株對甜櫻桃褐腐病具有一定生防作用的細菌。如表4所示，X-16菌株對褐腐病原菌的抑制效果最為明顯，病原菌菌落直徑最小，直徑為(1.74±0.08)cm，抑制率達(72.27±0.55)%。在P<0.05的情況下，每個處理組之間均成顯著性差異。

表4 內生拮抗細菌對甜櫻桃褐腐病原菌生長的抑制作用Table 4 Inhibition of endophytic antagonistic bacteria on the growth of sweet cherry brown rot pathogen

注：同列不同小寫字母表示不同處理組間差異顯著(P<0.05)(下同)；-表示無

2.2.2 X-16菌株的形態學鑒定

通過觀察，X-16生防菌菌落呈微黃色、形狀不規則，不透明；在顯微鏡下觀察到革蘭氏染色后菌體呈紫色短桿狀，判定X-16菌株為革蘭氏陽性菌。

2.2.3 X-16菌株的生理生化特征測定

參照《伯杰細菌鑒定手冊》方法，對菌株X-16進行革蘭氏染色、吲哚反應、接觸酶、檸檬酸鹽利用、V-P試驗、苯丙氨酸脫氫酶、硝酸鹽還原、糖醇發酵(產酸不產氣)、水解、耐鹽性、生長溫度范圍、pH等特性檢測，菌株X-16與特基拉芽孢桿菌(B.tequilensis)生理生化指標相同(表5)。

2.2.4 X-16菌株的16S rDNA序列鑒定

通過16S rDNA序列鑒定，在GenBank數據庫中BLAST比對，并利用MEGA 7.0軟件進行聚類分析構建系統發育樹，結果顯示，菌株X-16與特基拉芽孢桿菌(B.tequilensis)聚類(圖4)，同源性為98%，結合形態鑒定和生理生化鑒定結果，最終鑒定 X-16為特基拉芽孢桿菌(B.tequilensis)。

表5 菌株X-16生理生化分析結果Table 5 Physiological and biochemical analysis results of strain X-16

注：+表示有該特征或可利用該物質，-表示不具有該特征或不利用該物質

圖4 基于菌株X-16的16S rDNA基因序列構建的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree constructed based on the 16S rDNA gene sequence of strain X-16

2.3 拮抗菌X-16不同處理液對病原菌的拮抗效果

2.3.1 拮抗菌X-16生長曲線的測定

拮抗菌 X-16在 4 h時進入對數生長期，此時菌體生長速率最快，代謝旺盛；12 h時進入穩定生長期，此時總菌落數最大，代謝物質積累最多，重要的次級代謝產物在此時產生較多；當生長到24 h 之后菌體濁度開始降低，細胞出現凋亡(圖5)。

圖5 拮抗菌X-16的生長曲線Fig.5 Antagonistic bacteria growth curve of X-16

2.3.2 拮抗菌X-16菌懸液、發酵液、發酵上清液對病原菌的抑制效果

通過對不同處理組病斑直徑的測定發現，拮抗菌X-16菌懸液、發酵液和發酵上清液對病原菌的抑制效果不同(表6)。菌懸液(1×108CFU/mL)與對照組無顯著性差異，對褐腐病病原菌抑菌效果不明顯，而發酵液(1×108CFU/mL)和發酵上清液抑菌效果顯著(P<0.05)，抑菌率達到(71.93±0.18)%和(67.14±0.43)%。

表6 菌株X-16的菌懸液、發酵液、發酵上清液對病原菌的抑制效果Table 6 The effect of suppressing X-16 strain of the bacterial suspension, a fermentation broth, the fermentation supernatant pathogen

3 結論

對腐敗“美早”甜櫻桃樣品進行采后致病菌分離純化，通過形態學觀察、分子生物學技術與回接實驗，發現其發病特征與腐敗櫻桃發病特征一致，因此造成山東泰安地區“美早”甜櫻桃褐腐病的主要病原菌為美澳型核果褐腐病菌(Moniliniafructicola)，這與MENG等[32]和尹良芬[34]報道的核果/仁果類褐腐病菌結果相一致，而周芳[33]在研究山西省褐腐病菌種群時發現美澳型核果褐腐病菌(Moniliniafructicola)不是最主要的致病菌株，因此不同地區甜櫻桃褐腐病菌種群之間存在差異，需進一步探索褐腐病菌種群的遺傳多樣性，為不同地區核果/仁果類果實褐腐病的有效防治提供理論依據。

生防菌株的研發與應用對防止果蔬微生物病害具有重要意義。目前對特基拉芽孢桿菌的生防作用已有較多研究，謝潔等[35]研究表明特基拉芽孢桿菌對桑椹菌核病有較好抗性；GHOLAMI等[36]發現特基拉芽孢桿菌對大豆炭疽病具有一定拮抗效果；此外，特基拉芽孢桿菌對藍莓根霉病[37]、馬鈴薯黃萎病[38]也有一定防治效果。但國內外對于特基拉芽孢桿菌作為生防菌作用于甜櫻桃病害的防治缺乏相關研究，本研究從甜櫻桃本身篩到5株內生拮抗細菌，通過平板對峙選出抑菌效果最好的X-16，菌株鑒定為特基拉芽孢桿菌(Bacillustequilensis)，抑制率達(72.27±0.55)%，有較明顯的拮抗作用，填補了甜櫻桃褐腐病生物防治的空白，實際防治效果還需進一步大田試驗驗證。

特基拉芽孢桿菌所需營養簡單，生長繁殖能力快，防治效果好，具有成為優勢生防菌株的潛力。SINGH等[39]研究發現，特基拉芽孢桿菌可通過產生脂肽類或生物表面活性劑等破壞病原菌的生物膜，從而發揮抑菌作用。體外拮抗實驗表明，菌株X-16的發酵液與發酵上清液抑菌效果顯著，抑制率分別達(71.93±0.18)%和(67.14±0.43)%(P<0.05)，這可能與發酵液和發酵上清液中均含有抑菌活性的胞外分泌物有關，但發揮作用的抑菌活性成分及相關抑菌機理尚不明確，因此本實驗室會進一步研究抑菌活性成分的提取、純化及毒性檢測，為特基拉芽孢桿菌的生防利用奠定實驗基礎。