人體腸道中產尿酸氧化酶細菌的篩選、鑒定與酶學性質研究

張慶芳，王浚晨，于爽，劉春瑩，遲雪梅，遲乃玉

(大連大學 生命科學與技術學院，遼寧省海洋微生物工程技術研究中心，遼寧 大連，116622)

尿酸是人體嘌呤代謝的最終產物，很難被排出體外，如果在體內大量積累會引發高尿酸血癥，長期保持在高濃度將會進一步引發通風等疾病。隨著人們生活水平日益提高，人們日常攝入的牛肉、海鮮等高嘌呤食品也不斷增多，痛風的患病率逐年上升。尿酸氧化酶能夠有效催化尿酸降解生成尿囊素和CO2，使之在人體內快速降解。而人體自身無法合成尿酸酶，只能靠外界的攝入。自然來源的尿酸酶最早在牛胃中發現[1]，隨后從微生物中發現的尿酸酶被陸續報道。依靠繁殖快、產量大等特點，微生物很快成為尿酸酶的主要來源。

尿酸酶因其能夠快速降解尿酸的作用，很早便被用作醫藥用酶[2-4]。近年來，國內外針對尿酸酶的應用與研究也在不斷深入。在臨床檢測上，尿酸酶可以用來制備尿酸檢測試劑盒以供相關病患預防痛風等疾病；在臨床治療上，尿酸酶可以直接供高尿酸患者注射，有效降低尿酸濃度；在食品生產方面，尿酸酶亦可以用作食品添加劑專供高尿酸患者食用。根據早年報道，尿酸酶已經成功在乳酸菌、釀酒酵母等食用菌株中異源表達[5]，對微生物發酵工業有重要意義。

人體每天排出的尿酸，2/3從尿液中排泄，另外1/3則由腸道分解消化[6]。腸道吸收尿酸由腸道菌群參與代謝調控，腸道微生態環境在人體微生態系統中最為龐大，其含有的細菌種類繁多[7]。痛風患者的腸道菌群，由于受到高濃度尿酸的影響，相對于正常人存在失調現象,主要表現為產尿酸酶菌株增多，乳桿菌和雙歧桿菌減少[8]。本實驗設計從痛風患者糞便中篩選得到產尿酸氧化酶細菌，并對其菌株種類進行16S rDNA鑒定，最后對其產生的尿酸酶進行酶學性質研究，旨在針對功能性尿酸酶的開發與研究做出突破，得到高產尿酸氧化酶菌株，為日后尿酸酶的發酵生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 材料與試劑

選擇1名痛風患者新鮮糞便為樣品；

尿酸、酵母膏、NaCl、MgSO4、K2HPO4、KH2PO4、瓊脂、上海生工。

1.1.2 培養基

初篩培養基(g/L)：尿酸5，酵母膏0.5，NaCl 0.5，MgSO40.5，K2HPO42.0，KH2PO40.5，瓊脂20，pH 7.5；

復篩培養基(g/L)：尿酸5，酵母膏0.5，NaCl 0.5，MgSO40.5，K2HPO42.0，KH2PO40.5，pH 7.5；

菌株保藏培養基(g/L)：酵母膏3，蛋白胨5，NaCl 0.1，MgSO40.5，K2HPO42.0，KH2PO40.5，瓊脂20，pH 7.5。

1.1.3 儀器與設備

HZC-250雙層恒溫振蕩培養箱，北京佳源興業科技有限公司；WS-300恒溫培養箱，北京金達陽光科技有限公司；DK98-1水浴鍋，北京泰澤嘉業科技發展有限公司；KL-14105鼓風干燥箱，上海康朗生物科技有限公司；HBS-1906A酶標儀，上海研卉生物科技有限公司；YXQ-LS-75A壓力蒸汽滅菌鍋，北京佳源興業科技有限公司；Sorvall ST 8臺式離心機，北京昊諾斯科技有限公司；ELITE 300電泳儀，北京銘泰佳信科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株初篩

準備250 mL錐形瓶1個，取少量患者糞便置于瓶內，倒入100 mL無菌水振蕩混勻。隨后將混勻后的樣品進行梯度稀釋，分別涂布于初篩培養基上，37 ℃倒置培養，隨時觀察菌落形態與透明圈大小，挑選合適菌株進行復篩。

1.2.2 菌株復篩

將初篩得到的不同菌株分別接種于100 mL復篩培養基中，培養條件設置為37 ℃，120 r/min培育36 h，隨后對菌液進行酶活檢測，方法參考1.2.4，挑選出酶活最高的菌株。

1.2.3 菌株鑒定

1.2.3.1 形態學鑒定

將篩選得到的菌株接種于固體培養基(同初篩培養基)上，37 ℃劃線培養24 h，得到單菌落；標記單菌落，并觀察其菌落形狀、大小及顏色；利用接種環挑取合適菌株，通過革蘭氏染色，在光學顯微鏡(10×100)下觀察其形狀、排列及顏色，對其分類鑒定。

1.2.3.2 分子生物學鑒定

將篩選后的菌株進行16S rDNA基因擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳觀察擴增產物條帶大小，并對擴增產物進行基因測序，測序工作由上海生工完成；將測序結果經NCBI數據庫，進行BLAST比對，利用軟件MEGA5構建系統發育樹。

1.2.4 酶活鑒定

1.2.4.1 制備粗酶液

將菌株置于發酵培養基(同復篩培養基)中培育36 h、37 ℃、120 r/min，取菌液12 000 r/min離心10 min，倒掉上清液，將濕菌洗滌3次以上。利用超聲波破碎，參數設定為100 mL樣品，功率300 W，破碎時間3 s，間隔時間2 s，總時間15 min。將破碎得到的產物12 000 r/min離心15 min，提取上清液即粗酶液。

1.2.4.2 酶活測定方法

取150 μL 4-AAP(30 mmol/L)，100 μL TBHBA(1 mmol/L)，50 μL過氧化物酶(15 U/mL)，加入到25 mL比色管中，40 ℃預熱10 min，再加入粗酶液100 μL，600 μL硼酸鹽緩沖液(pH 8.4，0.1 mol/L)，0.2 g尿酸，去離子水定容至20 mL，分裝至96孔板，在540 nm處觀察吸光度的變化[9]。空白對照為硼酸鹽緩沖液。

酶活單位定義為37 ℃測定條件下，1 min催化產生1 μmol H2O2的酶量為1個酶活單位。

1.2.5 酶的分離純化

離心破碎后得到粗酶液，通過70%飽和(NH4)2SO4進行鹽析沉淀，4 ℃條件下過夜[10]，隨后經過透析袋，轉移到10 kDa超濾管中離心超濾；將超濾后的酶液進行Sephadex G-100 凝膠過濾層析，在每個洗脫峰處進行收集，分別檢測樣管酶活，收集酶活連續升高至降低的所有樣管即為純化后的尿酸氧化酶；最后通過SDS-PAGE電泳檢測純化后的產物，觀察分析其電泳條帶，并測定酶活大小，計算純化倍數。

1.2.6 酶學性質研究

1.2.6.1 最適作用溫度

收集一定量酶液，分別檢測10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70 ℃條件下各樣品酶活，共計3組平行實驗，最終測量結果最高值設定相對酶活為100%，計算剩余樣品比活力。

1.2.6.2 酶的最適pH

將酶液分別置于pH 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0不同緩沖液中，檢測各樣品酶活，共計3組平行實驗，最終測量結果最高值相對酶活設為100%，計算剩余樣品比活力。

1.2.6.3 酶的熱穩定性

將酶液分別置于20、30、40、50、60、70 ℃水浴鍋中保溫1 h，在37 ℃檢測各樣品殘留酶活，共計3組平行實驗，取最終測量結果最高值相對酶活設為100%，計算剩余樣品比活力。

1.2.6.4 pH對酶穩定性的影響

將酶液分別置于pH 2.0～11.0(條件同1.2.6.2)緩沖液中，37 ℃保溫1 h，檢測各樣品殘留酶活，共計3組平行實驗，取最終測量最高值相對酶活設為100%，計算剩余樣品比活力。

1.2.6.5 金屬離子對酶活的影響

在酶最適作用條件下，分別向酶液中加入Fe2+、Ca2+、K+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+等不同金屬離子緩沖液[11]，濃度設為5 mmol/L，測定不同金屬離子對酶活的影響，共計3組平行實驗。

2 結果與分析

2.1 菌株篩選

從5種產尿酸氧化酶菌株中篩選出1株酶活最高的菌株，參照1.2.4.2在37 ℃下檢測其酶活達到15.18 U/mg，命名為JC-5。

2.2 菌株鑒定

2.2.1 形態學鑒定

如圖1所示，菌落產生較大透明圈，呈白色圓形，邊緣規則，表面光滑，未產生孢子，革蘭氏染色呈紅色，鑒定為革蘭氏陰性菌。

A菌落形態；B-革蘭氏染色圖1 JC-5菌落形態及革蘭氏染色Fig.1 JC-5 colony morphology and gram staining

2.2.2 分子生物學鑒定

將擴增出的16S rDNA基因片段進行瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖2所示，在1 500 bp左右有明顯條帶。

M-Marker；1-16S rDNA圖2 菌株JC-5 16S rDNA瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Strain JC-5 16S rDNA agarose gel electrophoresis

隨后對基因序列進行測序，測序工作由上海生工完成，測序后得到的基因大小為1 493 bp，與電泳結果一致。將測序得到的16S rDNA基因序列在GenBank基因庫中進行BLAST比對，選擇同源性在99%以上的菌株及不同屬、種間相似度最高菌株基因序列，利用MEGA5構建系統發育樹，結果如圖3所示，菌株JC-5與彭氏變形桿菌Proteuspenneristrain 2203同源性最高，鑒定并命名為彭氏變形桿菌ProteuspenneriJC-5。

圖3 菌株JC-5 16S rDNA基因序列系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain JC-5 16S rDNA gene sequence

2.3 酶的分離純化

分離純化結果如圖4所示，提取部分粗酶液，加入70%飽和(NH4)2SO4過夜鹽析后，進行透析超濾，再經過SDS-PAGE電泳得到明顯蛋白條帶。隨后利用Sephadex G-100 凝膠過濾層析，在293 nm處檢測吸光度變化，并檢測吸收峰處的酶活，在25管檢測到酶活，表示目的蛋白開始被洗脫下來，32管酶活達到最高，41管檢測不到酶活，表明已被完全洗脫，收集此吸收峰內的產物即為純化后的尿酸氧化酶。對得到的純化產物進行SDS-PAGE電泳，結果如圖5所示，25～32管所收集的樣品在35 kDa左右有明顯條帶，33～40管開始出現雜條帶，推測其分子質量約為35 kDa。對純化后的樣品進行酶活檢測，酶總活力為51.48 U，詳細結果參照表1，酶比活為66 U/mg，純化倍數達到3.6。

M-Marker；1-粗酶液；2-粗酶液 (4 ℃過夜)；3-超濾圖4 粗酶液鹽析-SDS-PAGE電泳Fig.4 Crude enzyme solution salting out-SDS-PAGE electrophoresis

M-Marker；1-Sephadex G-100凝膠過濾層析(25～32管)；2-33～40管圖5 凝膠過濾層析-SDS-PAGE電泳Fig.5 Gel filtration chromatography-SDS-PAGE electrophoresis

表1 粗酶液分離純化結果Table 1 Crude enzyme solution separation and purification results

2.4 酶學性質研究

2.4.1 酶最適作用溫度及熱穩定性

對酶最適溫度的檢測結果如圖6所示，在35 ℃酶活達到最大，相對酶活定為100%，25～30 ℃時，相對酶活保持在80%左右，20 ℃酶活仍維持在50%，40 ℃開始酶活迅速下降，50 ℃相對酶活降至20%，60 ℃失活。針對該酶熱穩定性的檢測，由圖7可知，在30 ℃處理1 h后該酶保持一定酶活且相對穩定，在20 ℃處理1 h后仍有75%相對酶活，50 ℃處理1 h后相對酶活僅有6.2%，表明該酶熱穩定性較差。

圖6 酶最適作用溫度曲線Fig.6 Enzyme optimum temperature curve

圖7 酶的熱穩定性Fig.7 Thermal stability of the enzyme

2.4.2 酶的最適pH及穩定性

將酶置于pH 2.0～11.0的緩沖液中檢測其酶活，結果如圖8所示，在pH 8.0時酶活最大，相對酶活設為100%，隨著pH降低或升高，酶活緩慢下降，堿性環境pH 9.0～10.0條件下，相對酶活在80%左右，pH 11.0時相對酶活為68%；在酸性環境中pH 4.0～6.0時，該酶相對酶活在70%左右，pH 2.0時仍有21%的相對酶活。針對其耐酸堿穩定性研究結果如圖9所示，pH 8.0時檢測值最大，相對酶活設為100%，在pH 4.0～6.0時，相對酶活維持在50%以上，表明該酶具有一定的耐酸性，pH 7.0～9.0時相對酶活保持在80%以上，pH 11.0時的相對酶活降至20%，表明該酶在弱堿性條件下更利于保存。

圖8 酶的最適pH曲線Fig.8 Optimal pH curve of enzyme

圖9 不同pH對酶穩定性影響Fig.9 Effect of different pH on enzyme stability

2.4.3 金屬離子對酶活性的影響

結果如表2所示，Ca2+與Mn2+對酶有激活作用，Ca2+的激活作用較強，處理后的相對酶活達到132%，Fe2+、K+、Mg2+、Cu2+、Zn2+對酶活都有一定的抑制作用，Fe2+使酶活性降低50%。

表2 不同金屬離子對酶活的影響Table 2 Effects of different metal ions on enzyme activity

3 結論

本實驗從痛風病人腸道內篩選得到1株優產尿酸氧化酶菌株，命名為JC-5，通過16S rDNA測序，鑒定為彭氏變形桿菌。通過鹽析、G-100 凝膠過濾層析等步驟分離純化，該菌所產尿酸酶最終酶活達到66 U/mg。通過對其酶學性質研究，確認該酶最適作用溫度為35 ℃，并在30～40 ℃保持一定熱穩定性。該酶最適pH為8.0，在pH 7.0～9.0穩定性強。Ca2+與Mn2+對該酶有一定激活作用，Fe2+對酶抑制作用較強，與豬的腸道菌群所產酶的作用結果相似[12]。該酶在常溫狀態下熱穩定性一般，在保藏與運輸方面存在不足，未來可對其產酶基因進行修飾，用于工業化生產[13]。

4 討論

變形桿菌主要存在于人體及動物的腸道內，以奇異變形桿菌(P.mirabilis)最為常見，而后是普通變形桿菌(P.vulgaris)，彭氏變形桿菌(P.penneri)和摩爾根變形桿菌(P.morganii)相對較為少見[14]。奇異變形桿菌是引起人類食物中毒的主要菌株，一些還會造成泌尿感染、結石等疾病[15]。彭氏變形桿菌較為少見，一般在醫院環境及患者身上篩選得到[16]，與銅綠假單胞菌具有高度相似性(86%)。最早在1988年有報道表明，同其他變形桿菌一樣，該菌株也能催化尿素形成CO2和氨，影響尿液的pH變化導致尿道結石等疾病[17]。除了能夠產生尿素酶催化尿素反應外，變形桿菌在體內也可以產生大量尿酸酶用于降解尿酸，其在尿毒癥患者體內降解尿酸的能力僅次于大腸桿菌[18]。

本實驗從痛風患者糞便中篩選得到的產尿酸酶菌株通過系統發育樹鑒定為彭氏變形桿菌(P.penneri)，相對于其他種類變形桿菌，P.penneri可隨呼吸道侵染人體或動物，進入食道及腸道，當抵抗力下降時容易被感染。該菌株帶有一定的致病性，將來實驗可以對該產酶菌株的生長、發酵特性及毒理學進行研究；也可以將該菌株進行誘變育種，提取其產酶目的基因進行進行基因克隆工業化生產。

目前國內外少有關于尿酸酶熱穩定性的報道[19-20]，本實驗篩選菌株所產尿酸酶，最適溫度處于人體體溫范圍，適合用于痛風病人的臨床診斷與注射治療[21, 5]；在人體弱堿性環境中能夠有效降解尿酸，未來在醫藥用酶的開發方面亦有著很大發展前景[22]。但其在低溫環境下穩定性較差，不利于保存。張慶芳等[23]篩選的海洋來源菌株Z7所產低溫尿酸酶可以在20 ℃仍保持較好穩定性，將來可以更多地篩選生長在嚴苛環境下的產尿酸氧化酶菌株，針對其耐寒性、耐熱性及抗酸堿性作出研究；另一方面，將來可以對兩種產酶基因進行修飾，起到功能互補的作用。