超聲作用下乳蛋白-磷脂復合體系對人乳脂類似物乳液形成與穩定的影響

覃小麗，楊溶，鐘金鋒，劉雄

(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)

當純母乳喂養因生理和文化等原因不能進行時，嬰兒配方奶粉作為營養產品是理想選擇。在嬰兒配方奶粉生產的均質步驟中，人乳脂類似物乳液的形成通常通過蛋白質(如乳清蛋白、酪蛋白)和非蛋白乳化劑(如磷脂、甘油一酯)實現[1]。所得的人乳脂類似物乳液通過噴霧干燥轉化為奶粉或通過一定滅菌方式獲得液態形式的嬰兒配方奶產品。人乳脂類似物乳液的形成和穩定性被認為是影響嬰兒配方奶粉質量的因素之一。近年來，大多數研究主要集中在乳化劑的類型和組成[2-5]、非乳化劑成分(如乳糖)[6]、環境因素[7]和抗氧化劑[8-9]對人乳脂類似物乳液的形成和穩定性的影響。高壓均質方法是生產人乳脂類似物乳液的傳統均質方法。高壓均質法通常在兩步高壓均質條件(>10 MPa)下依賴強烈的剪切、撞擊和空穴作用得到分散體。許多研究表明，超聲均質法可以用于制備穩定的納米乳液[10-15]。YAO等[16]報道高壓均質使蛋白質吸附到牛乳脂肪球的油水界面形成了一層較厚的新脂肪球膜，導致其天然膜結構和組分含量發生了顯著變化。此類結構的變化進而影響乳脂在體外模擬嬰兒胃腸消化環境中的消化特性(脂肪、蛋白質水解)[17]。然而，其他類型均質方法應用于人乳脂類似物乳液制備的相關研究較少[18]，超聲均質法對人乳脂類似物乳液的形成和穩定的影響機理尚待解決。

因此，以乳蛋白-磷脂復合體系為研究對象，研究超聲時間(0～35 min)和超聲功率(0～600 W)對乳蛋白-磷脂復合體系的理化性質的影響；此外，初步探索不同超聲處理條件下乳蛋白-磷脂復合體系的理化性質變化與人乳脂類似物乳液形成和穩定的關系，為生產物理穩定良好的人乳脂類似物乳液提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳清蛋白(純度為80%)、酪蛋白和大豆磷脂，合肥博美生物科技有限責任公司；超純水，YSL-RO-T10L/H超純水系統(Ashland公司)制備；大豆油，重慶紅蜻蜓油脂有限責任公司；油茶籽油，江西春源綠色食品有限公司；椰子油，上海冉浩實業有限公司；考馬斯亮藍G-250、8-苯胺-1-萘磺酸等試劑，成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設備

Zetasizer Nano ZS90激光粒徑儀，英國Malvern公司；T18 ULTRA-TURRAX型高速均質機，德國IKA公司；JY98-IIIDN型超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司；PB-10標準型pH計，德國賽多利斯公司；UV-2450型紫外分光光度計，日本島津公司；F-2500型熒光分光光度計，日本日立公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 乳蛋白-磷脂復合體系的超聲處理

分別稱取一定質量的酪蛋白、乳清蛋白和磷脂于同一個燒杯中，加入0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)使其質量分數分別為0.70%、1.05%和0.5%，于30 ℃下磁力攪拌2 h，置于4 ℃靜置12 h保證蛋白質充分溶脹，得到乳蛋白-磷脂復合體系；此外，稱取相同質量的乳蛋白(酪蛋白、乳清蛋白)于燒杯中，加入0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)，按照乳蛋白-磷脂復合體系的溶解條件進行，得到乳蛋白溶液(質量分數之和為1.75%)，此溶液作為對照組。將超聲波細胞粉碎機的鈦探頭插入樣液液面下2 cm處，在20 kHz下對2種樣液進行超聲處理(作用時間5 s，間隔時間3 s)，用冰水浴使樣液溫度不超過35 ℃。超聲時間和功率的范圍按照QIN等[12]的研究確定，具體條件如表1所示。

1.3.2 乳蛋白-磷脂復合體系的性質表征

1.3.2.1 溶解度

參照孫燕婷等[19]和SN/T3926—2014的方法測定樣液中可溶性蛋白質的濃度。對超聲處理前后的樣液進行離心(10 000 r/min，10 min)，取上清液0.1 mL于10 mL具塞試管中加入5 mL考馬斯亮藍G-250染色液，使用紫外分光光度計在595 nm處測定樣液的吸光值。以牛血清白蛋白為標準物繪制標準曲線，樣液的溶解度表示為上清液可溶性蛋白質量相對于總蛋白質量含量的百分比。

表1 不同超聲處理參數Table 1 Different ultrasonic treatments

注：U-0、U-1、U-15和U-35為在不同超聲時間處理所得的樣品；U-0、U-60、U-15和U-600為在不同超聲功率處理所得的樣品

1.3.2.2 表面疏水性

乳蛋白的表面疏水性參照KATO等[20]的方法并稍作調整。將超聲處理前后的樣液于7 000 r/min離心20 min，取上清液，用磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L，pH=7.0)將上清液稀釋成不同的濃度梯度(0.005～0.04 mg/mL)。取4 mL各濃度的溶液，與40 μL的8-苯胺-1-萘磺酸溶液(8 mmol/L)振蕩均勻，避光靜置10 min保證充分反應，用熒光分光光度計測其熒光強度，具體參數設置激發波長365 nm，發射波長468 nm，夾縫為5 mm，掃描速度10 nm/s。以熒光強度對蛋白質濃度作圖，其初始段斜率(通過線性回歸分析計算)即為表面疏水性值。

1.3.2.3 濁度

采用可見紫外分光光度計測定不同超聲處理的乳蛋白-磷脂復合體系的濁度。樣液用超純水稀釋100倍，于600 nm處測量稀釋樣品的吸光度。以超純水作為空白對照。根據公式(1)計算各樣液的濁度：

(1)

式中：A，樣品稀釋后測定的吸光度；V，稀釋倍數；L，比色皿的寬度，1 cm。

1.3.2.4 粒徑和ζ-電位

采用Zetasizer Nano ZS 90測定樣液的粒徑和ζ-電位。為了盡量降低多重光散射效應，將樣液用超純水稀釋1 000倍。水相溶液的折射率設置為1.33，測試溫度為25 ℃，平衡時間為2 min。每個樣品平行測定3組，每組測定3次，每次測量值為13個子測試運行結果的平均值。

1.3.3 人乳脂類似物乳液的制備

以乳蛋白和磷脂為乳化劑，人乳脂類似物為油相，采用超聲均質法制備人乳脂類似物乳液。首先，分別稱取乳清蛋白、酪蛋白和磷脂于燒杯中，加入適量水于30 ℃下磁力攪拌2 h，調節水相pH值為6.8，使乳清蛋白、酪蛋白和磷脂的質量分數分別為1.05%、0.70%和0.5%，添加疊氮化鈉溶液(最終濃度為0.02%)抑菌，置于4 ℃靜置12 h使其中的乳蛋白充分溶脹，獲得水相。然后，按照QIN等[12]研究方法，將4種油[m(33L-分提豬油)∶m(油茶籽油)∶m(大豆油)∶m(椰子油)=54.80∶19.78∶15.14∶10.28)]物理混合制備成人乳脂類似物。將1.75 g人乳脂類似物添加于水相，攪拌(500 r/min，5 min)后高速均質(20 000 r/min，2 min)后，獲得粗乳液。最后，采用超聲處理粗乳液(工作時間為5 s，間歇時間為3 s)，用冰水浴使乳液溫度不超過35 ℃，得到人乳脂類似物乳液。以粒徑為評價指標，研究超聲條件對乳液形成與穩定的影響，具體超聲條件同表1。乳液的平均粒徑測定按照1.3.2.4進行。

1.4 數據處理

每組試驗至少重復2次，每個樣品的各指標至少平行測定3次，結果以平均值±標準偏差表示。使用SPSS 18.0軟件對數據進行單因素方差分析(P<0.05時判斷組間存在顯著差異)，并采用Spearman相關系數分析乳液的平均粒徑與乳蛋白-磷脂復合體系的物理性質之間的相關性。

2 結果與分析

2.1 超聲處理對乳蛋白-磷脂復合體系的理化性質的影響

2.1.1 粒徑和濁度

超聲處理對乳蛋白-磷脂復合體系的粒徑和濁度的影響如圖1所示。超聲處理后，乳蛋白-磷脂復合體系及對照組(乳蛋白溶液)的平均粒徑均顯著降低。粒徑尺寸的減少可能歸因于超聲空化現象，其可導致湍流和高剪切力[17]。這種湍流和高剪切力使乳蛋白和磷脂聚集體破碎成較小的聚集體。在超聲前，乳蛋白-磷脂復合體系的平均粒徑(317.97 nm)大于乳蛋白溶液的平均粒徑(248.03 nm)，但超聲處理后乳蛋白-磷脂復合體系的平均粒徑卻較小(圖1-A、圖1-B)。這可能因為磷脂是一種小分子乳化劑且具有一定黏稠性，因此在超聲處理前其在水中以大的聚集體形式存在，經過超聲空化作用后則被劇烈攪動破碎成更小的聚集體。因此，與乳蛋白溶液相比，乳蛋白-磷脂復合體系經超聲后其平均粒徑有更大程度地減小。

濁度作為一個支持性參數用于評估分散體中的粒徑變化[21]。如圖1-C、圖1-D所示，當超聲時間較短(1 min，樣品U-1)或功率較低(60 W，樣品U-60)時，濁度已有顯著降低。這是因為在超聲空化和機械攪拌下，大的磷脂聚集體迅速地破碎成小顆粒，小顆粒具有較大表面積因而增加了光的散射，從而降低了濁度。隨著超聲時間的延長或功率的增大，樣品濁度顯著降低。可見，超聲處理能有效降低乳蛋白-磷脂復合體系及對照組的濁度；且濁度與粒徑變化呈正比(R2>0.98)。

2.1.2 表面疏水性

表面疏水性可衡量蛋白質分子表面上與極性水環境接觸的疏水基團數量，并且與其功能特性密切相關[22]。圖2顯示了超聲對乳蛋白-磷脂復合體系中蛋白表面疏水性的影響。在相同的超聲處理條件下，乳蛋白-磷脂復合體系的表面疏水性是對照組(乳蛋白質溶液)的1.6～2倍。乳蛋白溶液和乳蛋白-磷脂復合體系中乳蛋白的質量分數雖然相同，但是乳蛋白-磷脂復合體系中蛋白的表面疏水性明顯大乳蛋白溶液。這可能主要有2個原因。其一，當超聲時間延長至35 min或超聲功率增大至600 W，對照組(乳蛋白溶液)的表面疏水性顯著增加(圖2)，這表明超聲處理引起蛋白質結構發生一定程度的展開，使埋藏在蛋白質內部的疏水基團暴露，因而乳蛋白的表面疏水性增加[23]。有研究指出不同來源的蛋白質(如乳清濃縮蛋白[24]、豌豆分離蛋白[25]、扇貝蛋白[26])經超聲處理后其表面疏水性增加。其二，與對照組(乳蛋白溶液)相比，乳蛋白-磷脂復合體系具有較高的表面疏水性。這表明乳蛋白和磷脂之間存在相互作用(主要為疏水相互作用[27])，該相互作用使蛋白質結構發生進一步改變，蛋白質分子表面上暴露出更多疏水基團，因而使乳蛋白-磷脂復合體系中的乳蛋白的表面疏水性增加。

A-不同超聲時間對平均粒徑的影響；B-不同超聲功率對平均粒徑的影響；C-不同超聲時間對濁度的影響；D-不同超聲功率對濁度的影響圖1 超聲處理對乳蛋白-磷脂復合體系的平均粒徑和濁度的影響Fig.1 Effect of ultrasonic treatment on the z-average diameter and turbidity of milk protein-lecithin solution注：不同顏色不同小寫字母表示具有顯著性差異(P<0.05)(下同)

A-不同超聲時間；B-不同超聲功率圖2 超聲處理對乳蛋白-磷脂復合體系的表面疏水性的影響Fig.2 Effect of ultrasonic treatment on the surface hydrophobicity of milk protein-lecithin solution

2.1.3 溶解度

蛋白質溶解度是反映蛋白質變性和聚集情況的最實用方法，可作為蛋白質功能評價的關鍵指標。圖3顯示了超聲處理對乳蛋白-磷脂復合體系的溶解度的影響。當超聲時間延長至35 min或超聲功率增大至600 W時，乳蛋白-磷脂復合體系中蛋白溶解度分別提高了1.52%和1.75%。這些結果表明，通過延長超聲時間和增大超聲功率可以改善乳蛋白-磷脂復合體系中蛋白的溶解度。其他課題組也報道了類似的結果[23, 28-30]，這些研究顯示超聲處理可以提高分離(或濃縮)蛋白的溶解度。超聲處理后乳蛋白溶解度的提高可歸因于其表面疏水性的增加(圖2)和蛋白質粒徑的減小(圖1)，在一定程度上增加了乳蛋白與水的相互作用。然而，乳蛋白-磷脂復合體系中蛋白溶解度提高程度低于乳蛋白溶液(超聲時間為35 min和600 W時分別提高了3.24%和3.21%)。這可能是因為乳蛋白-磷脂復合體系中磷脂與乳蛋白之間存在相互作用(從圖2中乳蛋白-磷脂復合體系的表面疏水性明顯增加可推測)，減少了乳蛋白與水的相互作用的程度，因此其溶解度提高程度低于乳蛋白溶液的溶解度。

一些研究發現，蛋白質表面疏水性越大，蛋白質溶解度越大[23, 31]。然而，在本研究中，與具有較低表面疏水性的乳蛋白溶液相比，具有較高表面疏水性的乳蛋白-磷脂復合體系的蛋白質溶解度并未增大(圖2 和3)。這些不同的研究結果可能歸因于分子間相互作用程度的差異。在溶液中沒有其他類型化合物存在的情況下，暴露在蛋白質表面的疏水基團可以與該溶液中的水相互作用；而在本研究乳蛋白-磷脂復合體系中，暴露在蛋白質表面的疏水基團不僅可以與體系中的水分子相互作用，而且與磷脂發生相互作用。相比于乳蛋白溶液，乳蛋白-磷脂復合體系的蛋白表面疏水性雖然較大(圖2)，但其蛋白溶解度略有降低(圖3)。

A-不同超聲時間；B-不同超聲功率圖3 超聲處理對乳蛋白-磷脂復合體系的溶解度的影響Fig.3 Effect of ultrasonic treatment on the solubility of protein-lecithin solution

2.1.4 ζ-電位

ζ-電位是溶液中顆粒表面電荷密度的量度，是評價膠體分散的潛在穩定性的關鍵指標。對于靜電穩定的分散體，ζ-電位的絕對值通常需要大于30 mV以防止分散體中顆粒聚集[32]。如圖4所示，在超聲處理前，乳蛋白-磷脂復合體系的ζ-電位絕對值為28.85 mV；當在超聲時間為1 min或超聲功率為60 W時，乳蛋白-磷脂復合體系的ζ-電位絕對值分別達到最大值(30.90 mV、31.25 mV)。ζ-電位絕對值的增加可歸因于超聲處理過程中磷脂聚集體的破碎，從而使磷脂的陰離子基團暴露在其分子表面。然而，當超聲時間延長至35 min或功率增大至600 W時，ζ-電位絕對值呈降低趨勢。這可能歸因于通過超聲處理使蛋白質分子的表面結構發生變化(圖2)，從而減少了蛋白質分子上的表面負電荷(圖4)。ζ-電位絕對值的降低會削弱顆粒之間的靜電排斥力，進而可能影響分散體的穩定性。

A-不同超聲時間；B-不同超聲功率圖4 超聲處理對乳蛋白-磷脂復合體系中ζ-電位的影響Fig.4 Effect of ultrasonic treatment on the ζ-potential of milk protein-lecithin solution

2.2 超聲處理對乳液形成與穩定的影響

以乳蛋白和磷脂為乳化劑，研究超聲時間與功率對人乳脂類似物乳液的形成與穩定的影響，結果如圖5所示。經過高速攪拌獲得的粗乳液在超聲處理前的粒徑最大(257.13 nm)，放置144 h后出現分層現象。隨著超聲時間或功率的增加，乳液的粒徑逐漸減小(圖5)。通常，乳液的粒徑穩定性取決于初始粒徑，并且具有較小初始粒徑的乳液可在更長的時間內保持穩定[33]。如圖5所示，當超聲時間分別為1、15和35 min時，乳液粒徑在144 h后分別增大了4.21、7.78和17.42 nm；當超聲功率分別為60、300和600 W時，乳液粒徑在144 h后分別增大了4.91、7.78和10.76 nm。雖然超聲時間最長的乳液(U-35)和超聲功率最大的乳液(U-600)具有較小的初始粒徑，但放置144 h后乳液粒徑的增大程度最大。這可能與乳化劑(乳蛋白和磷脂)在超聲過程中表面電荷發生改變有關(圖4)，其ζ-電位絕對值的降低減弱了顆粒之間的靜電排斥力，因而使乳液液滴易聚集、粒徑變大程度大。

A-不同超聲時間；B-不同超聲功率圖5 不同超聲條件下制備的乳液平均粒徑Fig.5 The z-average diameter of emulsions prepared under different ultrasonic conditions

2.3 不同超聲條件下乳液的粒徑變化與乳蛋白-磷脂復合體系的理化性質的關系

表2總結了人乳脂肪類似物乳液中粒徑變化與乳蛋白-磷脂復合體系的理化性質之間的相關性。乳液的粒徑與乳蛋白-磷脂復合體系的表面疏水性、溶解度的相關系數為r=-1.000(P<0.01，n=4)，表明乳液的粒徑變化分別與乳蛋白-磷脂復合體系的表面疏水性和溶解度的變化呈負相關性，即隨著超聲時間的延長或功率的增大，乳蛋白-磷脂復合體系的表面疏水性和溶解度越大，越有利于形成更小粒徑的乳液。乳液的粒徑分別與乳蛋白-磷脂復合體系的濁度呈正相關(r=-1.000，P<0.01，n=4)。隨著超聲時間的延長或超聲功率的增加形成更小粒徑的人乳脂肪類似物乳液，可從如下2個方面考慮：(1)當超聲時間或超聲功率增加時，乳蛋白和磷脂的大聚集物在超聲空化和剪切力作用下而形成更小的聚集體，從而減小了顆粒粒徑(圖1-A、圖1-B)。乳蛋白和磷脂顆粒的粒徑降低以及蛋白質結構的展開(表現在表面疏水性的增加，圖2)使乳蛋白與水之間的疏水相互作用增強。因此，增加了乳蛋白的溶解度(圖3)，這有利于增加其乳化活性[34]并形成具有小粒徑的乳液。(2)兩種乳化劑(乳蛋白質和磷脂)之間存在疏水相互作用，磷脂的存在明顯提高了乳蛋白的表面疏水性(圖2)，從而利于乳蛋白和磷脂的疏水基團吸附在小油滴表面上，因此防止可或減緩油滴在乳液形成過程中聚集。

乳液的粒徑與乳蛋白-磷脂復合體系的ζ-電位之間雖然沒有顯著相關性(表2)，但是乳液在儲藏過程中粒徑增長程度(圖5)與乳蛋白-磷脂復合體系的ζ-電位絕對值成反比。在長時間超聲或高功率下獲得的乳液粒徑增大程度可能是由于乳蛋白-磷脂復合體系的ζ-電位絕對值較低造成(圖4)，進而可能影響乳液的長期穩定性。

表2 乳液粒徑與乳蛋白-磷脂復合體系的理化性質 的關系Table 2 The correlation of z-average diameter in emulsions and physiochemical property of protein-lecithin solution

注：**相關性在0.01水平(雙側)顯著

3 結論

探究了不同超聲時間和功率下的乳蛋白-磷脂復合體系的理化性質及其對人乳脂類似物乳液形成與穩定的影響。結果表明，該復合體系中乳蛋白和磷脂之間存在的相互作用使乳蛋白的表面疏水性明顯提高，超聲處理也提高了乳蛋白的表面疏水性和溶解度以及降低乳蛋白-磷脂復合體系的粒徑，這些變化均有利于乳蛋白和磷脂的疏水基團吸附在超聲均質過程中形成的小油滴表面上，形成粒徑較小的乳液。此外，超聲時間的延長或超聲功率的增大使乳蛋白-磷脂復合體系的ζ-電位絕對值降低，這是導致具有較小粒徑的人乳脂類似物乳液在短期內粒徑增大程度快的原因，可能影響乳液的長期物理穩定性。研究結果為超聲均質法應用于生產嬰兒配方奶粉的品質調控提供了依據。