釀酒酵母pdc基因缺陷菌株的構建及其丙酮酸發(fā)酵特性

李億，秦艷，申乃坤，朱婧，梁戈，王青艷*

1(廣西科學院，國家非糧生物質能源工程技術研究中心，非糧生物質酶解國家重點實驗室，廣西生物煉制重點實驗室，廣西生物質工程技術研究中心， 廣西 南寧， 530007)2(廣西民族大學 海洋科學與生物技術學院，廣西微生物與植物資源利用重點實驗室， 廣西 南寧， 530008)

丙酮酸及其鹽作為一類重要的平臺化合物，在農用化學品、聚合物、化妝品、食品添加劑、醫(yī)藥等領域具有重要的應用[1-2]。例如，丙酮酸及其鹽是合成丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、N-乙酰-D-神經氨酸、二羥苯基丙氨酸(用于治療帕金森疾病)等貴重化合物的關鍵底物[2-3]；最近的臨床研究表明，丙酮酸能有效治療和預防與碳水化合物、脂肪和能量代謝紊亂(壓力、肥胖、糖尿病、心血管疾病等)有關的疾病[3]。傳統(tǒng)的丙酮酸生產通常采用化學法，該法雖然操作簡單，但也存在成本較高，產率低、污染環(huán)境等明顯缺點[4]；相比之下，微生物發(fā)酵法因具有以可再生生物質為底物、成本低廉、反應條件溫和、產品具有高純度等優(yōu)點[5]，更具市場競爭優(yōu)勢。

目前，丙酮酸發(fā)酵菌株研究最多的主要有多種維生素營養(yǎng)缺陷型光滑念珠菌(Candidaglabrata，之前稱為Torulopsisglabrata)[6-7]、硫辛酸營養(yǎng)缺陷型大腸桿菌(Escherichiacoli)[8-9]工程菌株。然而，由于T.glabrata和E.coli具有條件致病性[10-11]，很大程度上限制其應用范圍。相比之下，釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)因具有長期用于食品與釀造等領域，被認證為GRAS(generally regarded as safe)微生物，發(fā)酵產品具有安全性；遺傳背景清晰，有著較為完善的遺傳優(yōu)化工具，便于遺傳改造操作；能耐受低pH條件，可減少酸性產品的中和需求，有利于下游產品處理；抗?jié)B透性強，能耐受高濃度的產物和底物[12]等優(yōu)點，被認為是丙酮酸生產的潛在最適菌株之一，已引起國內外的廣泛關注。

然而，由于S.cerevisiae糖酵解過程產生的丙酮酸在胞質內的丙酮酸脫羧酶(pyruvate decarboxylase，PDC)催化作用下會迅速裂解為CO2和乙醛[13]，造成自身無法大量積累丙酮酸。因此，要實現(xiàn)S.cerevisiae大量積累丙酮酸，減弱丙酮酸的降解途徑是關鍵。減弱丙酮酸的降解途徑最直接的方法就是失活PDC，該酶受3個結構基因(pdc1、pdc5、pdc6)表達調控。同時敲除這3個結構基因會導致工程菌株無法在以葡萄糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長，但通過長期進化能獲得可利用葡萄糖積累丙酮酸的菌株[14-15]。

適應性進化又稱進化工程，是一種通過模擬自然進化中的變異和選擇過程，在人工選擇的壓力下實現(xiàn)微生物的進化，最后從進化菌群中篩選出優(yōu)良性狀的菌種改良技術[16-17]。該技術能夠驅使微生物種群或單細胞微生物在較短的時間內，為適應環(huán)境的變化，自身的DNA/RNA堿基或基因組結構等自發(fā)產生突變[17-18]。適應性進化不像基因工程那樣對微生物遺傳背景有很強的依賴性，因此該技術尤其適合對生理特性缺乏了解的菌種以及復雜性狀的選育。目前實驗室最常用的適應進化方法是在特定條件(給予選擇壓力)下將微生物連續(xù)傳代培養(yǎng)，通過菌株自發(fā)突變的不斷積累，獲得適應特定條件的表型或生理性能。

本研究以1株工業(yè)釀酒酵母XY-49為出發(fā)菌株，利用Cre/loxp同源重組方法敲除其丙酮酸脫羧酶基因(pdc1、pdc5、pdc6)，削弱或阻斷乙醇合成途徑，從而實現(xiàn)丙酮酸的積累；同時采用葡萄糖適應性定向進化策略對突變菌株進行傳代馴化培養(yǎng)，以期篩選到葡萄糖耐受度高、菌體生長速度快、丙酮酸高效積累的工程菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒

本研究所使用的釀酒酵母菌株如表1所示；敲除組件質粒pUG6、篩選標記回收質粒pSH65，均由本實驗室自存。

表1 本研究所用的釀酒酵母菌株Table 1 S. cerevisiae strains used in the present study

1.1.2 引物設計與合成

根據NCBI公布的釀酒酵母pdc1、pdc5和pdc6基因堿基序列，設計了表2中的PCR引物，所有引物均由上海Invitrogen公司合成。

表2 PCR引物Table 2 Primers used in PCR

注：下劃線部分代表目標基因的同源臂序列

1.1.3 酶與試劑

LATaqDNA聚合酶及其相關試劑,TaKaRa公司；乙醇脫氫酶、遺傳霉素(G418),索萊寶生物科技有限公司；博萊霉素(Zeocin),invitrogen公司；其余試劑為進口分裝或者國產分析純。

1.1.4 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨20，酵母粉 10，葡萄糖 20，pH自然，121℃ 滅菌20 min。

YPE培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨 20，酵母粉 10，乙醇 2%(體積分數)，pH自然，121 ℃滅菌20 min。

SD培養(yǎng)基(g/L)：酵母氮源(YNB) 6.7，(NH4)2SO45，葡萄糖 20，無菌0.22 μm濾膜除菌。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：初始葡萄糖80～100，酵母粉 10，胰蛋白胨 10，K2SO46，KH2PO43，MgSO40.5，金屬離子母液 10 mL/L，115 ℃，滅菌20 min。其中，糖與其他成分分開滅菌。

金屬離子母液(g/L)[19]：EDTA 1.5，ZnSO4·7H2O 0.45，CoCl2·6H2O 0.03，MnCl2·4H2O 0.1，CuSO4·4H2O 0.03，CaCl2·2H2O 0.45，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.3 g/L，NaMoO4·2H2O 0.04，H3BO40.1，KI 0.01。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因敲除

以XY-49為出發(fā)菌株，參照文獻[20]的方法分離制備其MATa和MATα兩型單倍體細胞，然后以質粒pUG6為模版，使用引物A和B(表2)進行PCR擴增，PCR條件為 95 ℃、3 min；95 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、1.8 min，30個循環(huán)；72℃、10 min。獲得的敲除組件片段含有目的基因上下游同源序列、loxp位點以及kamX抗性篩選標記。PEG/LiAc法分別轉化兩種配型單倍體細胞(MATa型和MATα型)，再分別涂布到含300 μg/mL G418的YPD(或YPE)平板上，30 ℃培養(yǎng)3～5 d，挑取克隆子進行擴培后提取基因組，以此為模版，使用引物F和R(表2)進行驗證。PCR條件為95 ℃、3 min；95 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、2 min，30個循環(huán)；72 ℃、10 min。將質粒pSH65轉化到陽性克隆子中，半乳糖誘導切除kamX抗性篩選標記，通過至少12次轉接培養(yǎng)移除pSH65，獲得陽性克隆子。本文遵循pdc6→pdc5→pdc1的次序重復以上過程將上述基因逐個敲除。

1.2.2 MATa型和MATα型單倍體雜交復倍

參照文獻[21]的方法，將1.2.1步驟中得到的具有相同基因突變類型的單倍體(MATa型和MATα型)進行雜交復倍，得到相應的二倍體菌株(表1)。

1.2.3 酶活檢測

粗酶提取：將釀酒酵母細胞接入100 mL YPD(含80 g/L 葡萄糖)培養(yǎng)基中，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)至對數期，然后12 000 r/min離心1 min收集細胞，用10 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH 7.0)清洗2次，懸浮并置于-20 ℃?zhèn)溆茫粰z測前用20 mL、100 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH 7.4)重懸，并加入1 mmol/L DTT，冰上冷凍5 min后在超聲波儀(輸出功率為200 W)中超聲5 s，冰上間隔冷卻1 min，重復過程15次。4 ℃、36 000×g條件下離心20 min，取上清即細胞提取物置于冰上，隨即用于酶活的檢測[22]。總蛋白量以考馬斯亮藍法[23]測定。

丙酮酸脫羧酶反應混合液每1 mL包含40 mmol/L咪唑鹽酸緩沖液，0.2 mmol/L硫胺素焦磷酸，0.15 mmol/L NADH，乙醇脫氫酶88 U/mL，5 mmol/L MgCl2，20 μL細胞破碎上清液，反應起始于50 mmol/L丙酮酸鉀的加入，并在30 ℃，pH 7.4條件下，測定OD340處的吸光度變化[19]。每分鐘催化1 μmol NADH氧化所需的酶量定義為1個酶活單位(U)。比酶活(U/mg)定義為每mg總蛋白所含有的酶活。

1.2.4pdc三重缺失突變株的葡萄糖適應性進化

針對pdc缺失突變株無法利用葡萄糖為唯一碳源進行批次發(fā)酵的問題，本文參照文獻[24]報道的方法對目標突變株進行了葡萄糖適應性定向進化篩選，以改善突變株的細胞生長及葡萄糖利用等生理指標。

1.2.5 突變菌株的生理特性試驗

從-80 ℃冰箱取出菌株在YPE(含2%乙醇)平板上劃線活化，30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d；挑取活化的單菌落接到5 mL液體YPE(含體積分數為2%乙醇)培養(yǎng)基中，30 ℃、 220 r/min培養(yǎng)2 d； 5 000 r/min、 離心5 min，棄掉上清液，用5 mL無菌水重懸；測定菌體的OD600值，接入裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基(含80 g/L葡萄糖)的250 mL三角瓶中，使發(fā)酵初始OD600≈0.2，30 ℃、220 r/min搖床培養(yǎng)96 h。

1.2.6 2 L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)

種子培養(yǎng)：將突變菌株XY-156A接入YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)48 h，種子連續(xù)活化2次。發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的種子液按照體積分數為10%的比例接入2 L發(fā)酵罐(上海百倫科技)，發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為1 L，發(fā)酵溫度設為30 ℃，攪拌轉速為400 r/min，通氣速率為0.75 L/min，在發(fā)酵過程中使用10 mol/L KOH自動維持pH=4.5。

1.2.7 分析方法

生物量測定：取0.5 mL菌液，稀釋適當倍數，利用Beckman coulter UV 800 紫外可見分光光度計在波長為 600 nm 條件下測定菌體濃度。

代謝產物分析：代謝產物采用高效液相色譜儀(戴安Ultimate 3000)分析，丙酮酸用紫外檢測器(ultraviolet absorption detector,UV)檢測，檢測波長為210 nm；乙醇用視差檢測器(refractive index detecor,RI)檢測，色譜柱為Phenomenex Rezex ROA-Organic Acid H+(8%)(300 mm×7.8 mm)，流動相為2.5 mmol/L H2SO4，流速為0.6 mL/min，柱溫50 ℃。葡萄糖測定采用SBA-40D生物傳感分析儀。

2 結果與分析

2.1 pdc基因敲除轉化子的驗證結果

從G418抗性平板上挑取陽性克隆子，擴大培養(yǎng)并提取基因組DNA作為模版，以對應配型的親本菌株(MATa型和MATα)為對照，分別以P6-F/P6-R、P5-F/P5-R和P1-F/P1-R(表2)為引物進行PCR全長驗證，如圖1所示，對照擴增出2.4 kb左右大小的pdc6基因片段，轉化子則擴增出大小約為2.0 kb的基因片段，與預期結果相符，證明pdc6基因敲除組件片段已成功置換pdc6基因的開放閱讀框(open reading frame，ORF)，pdc6基因被敲除。同理，如圖2和圖3所示，證明pdc5和pdc1基因敲除組件片段已成功置換各自的ORF區(qū)域，pdc5和pdc1基因被敲除。

M,DL5000DNA marker;1，缺失開放閱讀框的pdc6基因的PCR產物；2，pdc6基因的PCR產物圖1 基因pdc6突變子PCR驗證Fig.1 PCR verification of gene pdc6 mutant

M,DL5000DNA marker;1，缺失開放閱讀框的pdc5基因的PCR產物；2，pdc5基因的PCR產物圖2 基因pdc5突變子PCR驗證Fig.2 PCR verification of gene pdc5 mutant

M,DL5000DNA marker;1，缺失開放閱讀框的pdc1基因的PCR產物；2，pdc1基因的PCR產物圖3 基因pdc1突變子PCR驗證Fig.3 PCR verification of gene pdc1 mutant

2.2 PDC酶活的檢測分析

按照1.2.3的方法，進一步通過測定突變株的PDC酶活，以最終確定pdc三個等位基因被敲除，結果如表3所示。由表3可知，當釀酒酵母的pdc6基因缺失后，其比酶活為原始菌株的92%；當pdc5和pdc6同時缺失之后，其比酶活為原始菌株的86%；當pdc1、pdc5和pdc6同時缺失之后，其比酶活為原來的0.3%，說明pdc3個等位基因已成功缺失。

表3 突變菌株丙酮酸脫羧酶比酶活Table 3 Specific pyruvate decarboxylase activity of wild-type and pdc mutant strains

2.3 突變菌株的生理特性發(fā)酵試驗

細胞生長及耗糖情況的測定：搖瓶液體平行培養(yǎng)XY-49、XY-6、XY-56、XY-156和XY-156A菌株，測定整個生長過程的菌體生物量(OD600)及耗糖情況，結果如圖4所示。pdc6單獨缺失，菌體生長、葡萄糖消耗速率幾乎不受影響；pdc5和pdc6雙基因缺失對其葡萄糖消耗速率影響很小，但其菌體生物量相比原始菌株稍有降低；pdc1、pdc5和pdc6三基因缺失后，突變株(XY-156)生長延滯期變長，對數期較短，發(fā)酵進行到60 h時，其生物量(OD600)為2.21±0.12，較野生菌株XY-49下降了86%。此時，突變株XY-156葡萄糖消耗了(14.55±1.02) g/L，野生菌株消耗了(79.3±1.2) g/L，表明pdc三個等位基因缺失之后，菌株的生長、葡萄糖消耗受到了較為強烈的影響。

A-細胞生長；B-葡萄糖消耗圖4 不同突變菌株的細胞生長和葡萄糖消耗情況Fig.4 Cell growth and glucose consumption of different mutant strains

突變菌株產乙醇、丙酮酸情況的測定：在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，定期取樣檢測發(fā)酵液中乙醇、丙酮酸的含量，考察pdc基因缺失對其主要代謝產物(乙醇、丙酮酸)合成的影響，結果如表4所示。當pdc6單基因缺失或pdc5和pdc6雙基因缺失時，獲得的突變菌株(XY-6、XY-56)與對照菌株XY-49相比，乙醇合成幾乎不受影響，丙酮酸積累量很低；而當pdc1、pdc5和pdc6三基因缺失以后，突變菌株XY-156的丙酮酸積累量較對照菌株XY-49有了大幅提升，發(fā)酵過程中沒有乙醇產生。

表4 突變菌株主要代謝產物的檢測 單位：g/LTable 4 Determination of main metabolites of different mutant strains

結合表3、表4和圖4可知，pdc6單獨缺失或pdc5和pdc6同時缺失對細胞生長、葡萄糖利用、乙醇以及丙酮酸積累影響不大，說明pdc5、pdc6在PDC表達中不起主導作用，這與文獻[19]報道一致。同時敲除pdc1、pdc5和pdc6，可完全消除乙醇并實現(xiàn)丙酮酸積累，但同時也導致了突變菌株XY-156對葡萄糖敏感、細胞生長緩慢。這是由于pdc基因缺失以后，胞質內缺少乙酰-CoA(由PDC酶催化丙酮酸脫羧而來)供應，脂質、賴氨酸的生物合成過程受阻所致[15]。此外，由圖4和表4可知，雖然進化突變菌株XY-156A的生物量和糖耗速率仍不及原始菌株XY-49，但與進化前菌株XY-156相比，其在細胞生物量、丙酮酸積累、葡萄糖耐受及消耗速率方面均有顯著提高。目前，有關pdc-進化突變株耐受葡萄糖機制的解釋主要有以下兩種：(1)胞質乙酰-CoA替代路徑的激活。VAN MARIS 等[25]研究發(fā)現(xiàn),蘇氨酸醛縮酶(該酶可以將蘇氨酸裂解為甘氨酸和乙醛)的胞質錨定位點，并試圖引入一條胞質乙酰-CoA合成替代路徑；通過過表達蘇氨酸醛縮酶編碼基因gly1，pdc-菌株在碳源限制的條件下可利用葡萄糖作為唯一碳源進行生長，表明該酶催化形成的乙醛可作為胞質乙酰-CoA合成的前體，該研究結果較好地論證了這一假設，但仍無法解釋gly1過表達的pdc-菌株在批次培養(yǎng)中對高濃度葡萄糖敏感的現(xiàn)象；(2)葡萄糖攝取過程的調控。OUD等[26]對1株不依賴C2化合物的S.cerevisiaeTAM進行轉錄組分析時發(fā)現(xiàn)一個葡萄糖攝取負調控因子(mth1)內部堿基發(fā)生了突變，并通過后續(xù)試驗推測MTH1降解減少導致的葡萄糖攝取下調或許是pdc-菌株耐受高濃度葡萄糖的原因。

2.4 2 L發(fā)酵罐發(fā)酵實驗

通過葡萄糖適應性定向進化策略篩選得到突變菌株XY-156A之后，進一步利用2L發(fā)酵罐對其積累丙酮酸能力進行放大試驗。發(fā)酵初始糖質量濃度為98 g/L，當葡萄糖質量濃度降至約10 g/L時，補加800 g/L葡萄糖母液使糖質量濃度恢復至80～90 g/L，整個發(fā)酵過程共補料2次。定期取樣檢測發(fā)酵過程中丙酮酸、殘?zhí)菨舛纫约吧锪康淖兓闆r，取3次試驗的平均值，結果如圖5所示。

圖5 S.cerevisiae XY-156A利用葡萄糖批次補料發(fā)酵產丙酮酸過程曲線Fig.5 Fed-batch fermentation profile of pyruvic acid production from Glucose by S.cerevisiae XY-156A

在0～30 h，隨著糖的不斷消耗，菌體生物量、丙酮酸濃度不斷增長；在30～52 h，期間共進行2次補料，丙酮酸濃度繼續(xù)攀升，菌體生物量在52 h時達到最大(OD600=35.56)；52 h后，糖耗速率放緩，菌體生物量也隨之緩慢下降，丙酮酸濃度繼續(xù)緩慢增加。發(fā)酵76 h后，丙酮酸濃度達到105 g/L，得率為0.5 g/g葡萄糖，生產強度為1.38 g/(L·h)。與搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)相比，發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)階段的菌體生長速率、生物量、糖耗速率以及丙酮酸終濃度均有大幅度提升。這可能是由于發(fā)酵罐體系的溶氧比搖瓶體系更為充足， 因而更有利于pdc-突變菌株通過線粒體呼吸鏈將糖酵解過程產生的NADH快速氧化生成NAD+[27]，以維持胞內的氧化還原平衡，而NADH的減少則可促使更多的葡萄糖轉化為丙酮酸。此外，發(fā)酵罐的傳質傳熱效果更好，菌體與物料接觸更充分，從而更有利于菌體生長和產物合成。

3 討論

近年來，國內外針對改造S.cerevisiae生產丙酮酸開展了大量的研究工作，并且取得了不錯的進展。例如，WANG等[28]以單倍體菌株Y2為出發(fā)菌株，通過同源重組技術敲除PDC的編碼基因pdc1和pdc5使PDC酶活下降了98%，但獲得的突變株Y2-15需要添加醋酸鈉或者其他C2化合物才能正常生長，搖瓶發(fā)酵96 h獲得24.85 g/L丙酮酸，生產強度為0.26 g/(L·h)，丙酮酸得率為0.37 g/g葡萄糖。VAN MARIS等[14]通過敲除PDC的編碼基因pdc1、pdc5和pdc6，獲得的突變株RWB837同樣無法在以葡萄糖為唯一碳源的合成培養(yǎng)基上生長，隨后對該菌株進行葡萄糖適應性進化篩選，最終獲得1株能利用葡萄糖積累丙酮酸的進化突變株TAM，分批補料發(fā)酵100 h獲得135 g/L丙酮酸(目前報道的最高產量)，生產強度為1.35 g/(L·h)，丙酮酸得率為0.54 g/g葡萄糖。WANG等[24]也采用類似進化策略對1株PDC突變株BY5419進行馴化，最終篩選到了1株產丙酮酸的菌株BY5419-A0，通過搖瓶發(fā)酵120 h獲得66.4 g/L丙酮酸，生產強度為 0.55 g/(L·h)，丙酮酸得率為0.55 g/g葡萄糖。上述研究均使用單倍體營養(yǎng)缺陷型S.cerevisiae作為出發(fā)菌株，使其不能直接利用簡單培養(yǎng)基，需要添加氨基酸或維生素等，增加了發(fā)酵過程的控制難度和發(fā)酵成本，不利于大規(guī)模工業(yè)化應用。本研究以二倍體工業(yè)釀酒酵母XY-49為出發(fā)菌株，通過失活PDC結合適應性定向進化的策略，最終篩選到葡萄糖耐受度高、菌體生長速度快、丙酮酸高效積累的進化突變株XY-156A。通過分批補料發(fā)酵76 h，丙酮酸濃度可達105 g/L，生產強度為1.38 g/(L·h)，丙酮酸得率為0.5 g/g葡萄糖，試驗結果顯示該菌株在丙酮酸工業(yè)生產中具備一定的應用潛力。但其所獲得的丙酮酸得率(0.5 g/g葡萄糖)仍然較低，因此，有必要進一步改造XY-156A以提高其丙酮酸生產指標。首先，繼續(xù)敲除其余丙酮酸降解途徑的相關基因。除了PDC以外，仍然存在一些可降解丙酮酸的酶，例如，丙酮酸脫氫酶(pyrucate dehydrogenase,PDH)和丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase,PYC)，敲除這些酶的編碼基因可進一步減少丙酮酸代謝[27]。其次引入輔酶再生系統(tǒng)。PDC缺失后，糖酵解過程產生的大量NADH無法快速轉化為NAD+，細胞的氧化還原平衡被破壞，而引入輔酶系統(tǒng)促進NAD+再生，可將更多的葡萄糖轉化為丙酮酸，從而提高丙酮酸得率[24]。最后，對發(fā)酵條件進行綜合優(yōu)化，為S.cerevisiae工業(yè)化生產丙酮酸奠定堅實的基礎。