木聚糖—鐵復合物的制備工藝優化及抗氧化活性研究

李 霞 孫鶴飛 - 陶揚妃 - 陳 清 周玉恒 - 單 楊 關 媛 an

(1.桂林理工大學化學與生物工程學院，廣西 桂林 541006；2.廣西植物研究所，廣西 桂林 541006; 3.湖南省農科院農產品加工研究所，湖南 長沙 410125)

木聚糖(Xyl)是自然界中含量豐富的多糖，具有甜度低、熱量少、可發酵、潤腸通便等特性；對雙歧桿菌有顯著增殖作用，可促進機體對鈣和鐵的吸收[1]。Xyl常作為促進人體鈣、鐵吸收，增強人體免疫等的功能性保健品[2]。此外，Xyl主鏈木糖重復單元上的糖基側鏈的多變性及羥基的存在為其化學修飾提供了可能[3]。鐵是人體中最重要的微量礦物質之一，對有機體的正常功能，尤其是作為新陳代謝和免疫功能的輔助因子的活性至關重要[4]。人體內缺乏鐵時會出現乏力、免疫力下降及貧血等癥狀[5]，而缺鐵性貧血已成為一種世界上常見的營養性疾病。目前，補鐵劑主要有無機和有機兩種形式，無機鐵會導致腸胃不適及口腔異味等[6-7]，因此多糖鐵復合物作為一種有機鐵補充劑已成為研究熱點。

多糖鐵復合物具有較理想的穩定性和水溶性，具有免疫保護作用等優點，生物利用度高于無機補鐵劑[8]。肖雄等[9]研究發現土黨參多糖鐵配合物在pH 3～12時可溶且能穩定存在；張喜峰等[10]研究表明螺旋藻多糖鐵配合物具有較高免疫作用與較好的生物活性；Tang等[4]研究發現茶多糖鐵配合物具有增加鐵的吸收和生物利用度的能力。此外，多糖鐵復合物具有良好的臨床效果，且鮮有不良反應，可作為優良的補鐵劑治療缺鐵性貧血癥[11]。但關于Xyl修飾成多糖鐵復合物及生物活性方面的研究鮮有報道。

試驗擬以Xyl和FeCl3為底物，采用響應面分析法優化木聚糖—鐵復合物(XPC)的制備工藝，通過紅外光譜及X-射線衍射對Xyl和XPC結構進行表征和分析，并對Xyl和XPC的抗氧化活性進行研究，以期為治療缺鐵性貧血及Xyl的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Xyl：廣西植物研究所；

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：生物試劑，東京化成工業株式會社；

氯化鐵、抗壞血酸、氫氧化鈉等：國產分析純；

傅里葉紅外光譜儀：IS10型，美國Thermo Fisher公司；

X-射線衍射儀：Xpert3Power型，荷蘭帕納公司；

紫外—可見分光光度計：UV760CRT型，上海傲譜分析儀器有限公司；

冷凍干燥機：FD-1B-50型，北京博醫康實驗儀器有限公司；

離心機：DL-5-B型，上海安亭科學儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 XPC的制備 稱取60 mg Xyl及20 mg檸檬酸鈉，用30 mL蒸餾水溶解，70 ℃水浴并不斷攪拌。先逐滴加入20% NaOH溶液調節反應體系pH為8.0，之后緩慢滴加2.0 mol/L FeCl3溶液并攪拌，重復上述過程，保持反應體系pH為8.0。當反應體系中出現紅棕色不溶沉淀時，停止滴加。70 ℃水浴1 h，4 000 r/min離心15 min，收集上層深紅棕色離心液，流水透析24 h，濃縮冷凍干燥，得XPC。

1.2.2 單因素試驗

(1)Xyl與檸檬酸鈉質量比：制備溫度70 ℃，pH 8.0，考察Xyl與檸檬酸鈉質量比(1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1)對XPC得率的影響。

(2)制備溫度：Xyl與檸檬酸鈉質量比3∶1，pH 8.0，考察制備溫度(60，70，80，90，100 ℃)對XPC得率的影響。

(3)pH：Xyl與檸檬酸鈉質量比3∶1，制備溫度70 ℃，考察pH(7.0，7.5，8.0，8.5，9.0)對XPC得率的影響。

1.2.3 響應面試驗設計 基于單因素試驗，以Xyl與檸檬酸鈉質量比、制備溫度、pH為自變量[12]，XPC得率為響應量，設計三因素三水平的優化試驗[13]。

1.2.4 XPC得率的測定 按照鄰菲羅啉法[14]測定吸光度值，根據標準曲線(y=0.204 9x+0.003 1，R2=0.999 9，其中y為吸光度值，x為Fe2+濃度)計算鐵的含量，并按式(1)、(2)分別計算XPC中含鐵量及XPC得率。

(1)

式中：

S——XPC中含鐵量，%；

C——Fe2+的質量濃度，mg/mL；

0.08——XPC的濃度，mg/mL。

(2)

式中：

Y——XPC得率，%；

C0——螯合前溶液中鐵質量濃度，mg/mL；

C1——為螯合后溶液中鐵質量濃度，mg/mL。

1.2.5 XPC的結構特征

(1)紅外光譜分析：根據文獻[15]。

(2)X射線衍射分析：根據文獻[16]略作修改，采用X'Pert3Powder型多功能X-射線衍射儀(Cu靶，λ=1.540 56 ?)分析Xyl和XPC的晶體結構，測試掃描步長為0.026 26°，掃描范圍5°～ 90°，掃描速度0.656 5°/s。

1.2.6 XPC的抗氧化活性測定

(1)DPPH自由基清除能力：參考文獻[17]的方法并略有改動，量取不同濃度的樣品液2.0 mL，加入0.04 mg/mL DPPH溶液2.0 mL(乙醇作為溶劑)，室溫下混勻后避光反應30 min，517 nm處測定吸光值。按式(3)計算DPPH自由基清除率。

(3)

式中：

K——DPPH自由基清除率，%；

Ai——2.0 mL樣品液和2.0 mL DPPH乙醇溶液的吸光度；

Aj——2.0 mL乙醇和2.0 mL樣品液的混合液的吸光度；

Ac——2.0 mL乙醇和2.0 mL DPPH溶液混合液的吸光度。

(2)超氧陰離子清除能力：根據文獻[18]。

(3)羥基自由基清除率能力：參考文獻[19]的方法并略作改動，取9.0 mmol/L FeSO4和9.0 mmol/L水楊酸—乙醇溶液各1.0 mL，加入不同濃度的樣品溶液1.0 mL，混均后加入8.8 mmol/L H2O2溶液1.0 mL啟動反應，37 ℃水浴30 min，于510 nm處測定吸光度，每組測3次，取平均值。在其他條件不變下改動3種試劑進行相應試驗：蒸餾水代替多糖做空白對照，蒸餾水替換H2O2溶液測定多糖本底液吸光度，以抗壞血酸替換XPC為陽性對照。按式(4)計算羥基自由基清除率。

(4)

式中：

E——羥基自由基清除率，%；

A0——空白對照液的吸光度；

Ax——樣品液的吸光度；

Ax0——多糖本底溶液的吸光度。

(4)還原性能力：參考楊柳等[20]的方法并略作修改，量取0.5 mL不同濃度的樣品液于試管，依次加入0.5 mL的1% K3Fe(CN)6溶液與0.5 mL的PBS溶液(0.2 mol/L，pH 6.7)，50 ℃水浴20 min，冷卻，依次加入0.5 mL的10% TCA溶液，0.5 mL的0.1% FeCl3溶液及2.0 mL蒸餾水，混勻后靜置10 min，于700 nm處測定其吸光度值，以抗壞血酸為陽性對照。

1.3 數據分析

采用Excel軟件和Design-Expert 8.0.6軟件中的多元線性回歸分析程序對驗結果進行處理，所有數據均為3次重復試驗的平均值。采用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析，P<0.05差異顯著，P<0.01差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

由圖1可知，當Xyl與檸檬酸鈉質量比為3∶1時，產物得率最高(62.9%)；螯合的最適溫度為70 ℃，溫度過低不利于Xyl與鐵離子的螯合，溫度過高可能會破壞Xyl的自身結構；當pH為8.0時，XPC得率最大，說明pH的增大有利于Xyl的溶解和擴散，但pH過高會使OH-與Xyl分子的活性基團競爭，與Fe3+結合形成沉淀，導致Fe3+不能與Xyl螯合[21]。

圖1 單因素對XPC得率的影響

2.2 制備工藝優化

2.2.1 響應面試驗分析 綜合單因素試驗結果，以Xyl與檸檬酸鈉質量比、制備溫度和pH為影響因素，以XPC得率為響應值，根據Box-Behnken試驗設計原理進行試驗設計，因素與水平表見表1，試驗設計及結果見表2。

如表2可知，XPC得率為46.44%～65.91%，對試驗數據進行二次多項式回歸擬合，得回歸方程：

Y=59.68+3.50A+5.95B+3.25C+2.70AB-1.60AC-1.30BC-2.54A2-3.69B2+0.31C2。

(6)

2.2.2 響應面回歸模型分析 由表3可知，模型P<0.01，說明回歸模型具有高度顯著性；失擬項P=0.238 1>0.05，說明失擬項不顯著；模型R2=0.983 3，表明可用該模型解釋98.33%的關于各因素與得率之間的關系變化；RAdj2=0.961 7，表明回歸方程的擬合程度較好，試驗誤差較小，可信度較高[22]，能很好地對XPC得率進行分析和預測。回歸模型中一次項A、B、C及交互項AC影響極顯著(P<0.01)，二次項(A2、B2)具有高度顯著性(P<0.01)；各因素對XPC的影響大小依次為pH>制備溫度>Xyl與檸檬酸鈉質量比。

由圖2可知，制備溫度對XPC得率的影響最大，其次是Xyl與檸檬酸鈉質量比和pH；Xyl與檸檬酸鈉質量比和制備溫度的等高線為橢圓形，說明這兩個因素交互作用顯著，而Xyl與檸檬酸鈉質量比和pH的等高線以及制備溫度和pH的等高線皆為圓形，說明Xyl與檸檬酸鈉質量比和pH、制備溫度和pH間的交互作用不明顯，與方差分析結果一致。

表1 因素與水平表

表2 響應面試驗設計及結果

Table 2 Experiments design and results of response surface analysis

試驗號ABCY多糖得率/%11-1048.53200060.91301163.344-10-148.525-10159.9160-1-146.71700058.83810163.2190-1154.131000058.7111-10053.031211065.911300060.511410-158.221501-161.131600059.5117-1-1046.44

表3 回歸模型方差分析?

Table 3 Regression model variance analysis results

來源平方和自由度均方和F值P值顯著性模型600.98966.7545.69<0.0001??A98.00198.0067.07<0.0001??B283.221283.22193.83<0.0001??C84.50184.5057.830.0001??AB29.16129.1619.960.0029??AC10.24110.247.010.0331?BC6.7616.764.630.0685?A227.16127.1618.590.0035??B257.33157.3339.240.0004??C20.4010.400.280.6150殘差10.2371.46 失擬項6.3032.102.140.2381不顯著誤差3.9340.98總和611.0116

? *表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)；R2=0.983 3；RAdj2=0.961 7。

2.2.3 模型驗證實驗 利用Design-Expert 8.0.6軟件分析，得到最佳制備條件為Xyl與檸檬酸鈉質量比為3.2∶1、制備溫度70 ℃、pH 8.09，此條件下XPC得率為66.59%。為驗證模型的可靠性與方便實際操作，將工藝參數修正為Xyl與檸檬酸鈉質量比3∶1、制備溫度70 ℃、pH 8.0，此條件下制備的XPC得率為66.35%，與預測值接近，說明基于響應面法優化工藝可靠。

圖2 因素間的交互作用對XPC得率的影響

Figure 2 Response surface of yield of XPC affected by different variables

2.2.4 鐵含量的測定 由標準曲線方程得XPC中鐵含量為22.57%。王花等[21]研究的大棗多糖鐵復合物中鐵含量為20.26%；李玉賢等[23]制備的百合多糖鐵中鐵(Ⅲ)含量為20.81%；王峰等[24]研究的絞股藍多糖鐵中鐵含量為29.14%。結果表明，最佳制備條件下的XPC不僅得率可觀，鐵含量也較高。

2.3 XPC結構特征

2.3.1 紅外光譜分析 由圖3可知，Xyl和XPC在3 000 cm-1處有一強烈的吸收峰，為XPC中-OH的伸縮振動吸收，峰的強度和形狀的差異表明XPC的結構中有更多的羥基，與金屬離子結合后，該吸收峰趨勢較陡，說明多糖中的—OH參與了絡合反應[25]；3 000～2 900 cm-1處存在小的吸收峰，為XPC中C—H的伸縮振動；1 200～1 000 cm-1處的吸收峰是由C—O伸縮振動引起的；但在XPC光譜中有兩個峰值顯示一些遷移(1 633，1 045 cm-1)，表明鐵(Ⅲ)和Xyl有被羥基結合的可能[4]；碳水化合物指紋區1 000～400 cm-1處的吸收帶對XPC的變化敏感；862 cm-1處有一特殊吸收峰，與文獻[26]報道的β-FeOOH的特征吸收一致，表明XPC中的鐵都是以聚合的β-FeOOH鐵核結構存在的。

圖3 XPC和Xyl的紅外圖譜

Figure 3 The infrared spectroscopy spectrum of XPC and Xyl

2.3.2 X-射線衍射分析 由圖4可知，Xyl和XPC未出現尖銳的吸收峰，修飾前后粉末衍射圖譜趨勢基本一致，說明形成復合物后，未破壞多糖結構的基本骨架。XPC未呈現晶體的趨勢，結構基本上是無定形的，與文獻[27]基本一致。此外，XPC的X-射線衍射圖譜不含FeCl3中的特征衍射峰，表明鐵(Ⅲ)可以與Xyl螯合并廣泛分散在糖鏈中。

2.4 抗氧化活性分析

由圖5可知，XPC對DPPH自由基的清除活性較顯著，當樣品濃度為0.1～2.0 mg/mL時，XPC對DPPH自由基的清除能力呈現一定劑量效應，隨樣品濃度的增高而增大；當樣品濃度為2.0 mg/mL時，XPC對DPPH自由基的清除率達到最大值73.44%，比Xyl的高64.48%。當樣品濃度為0.1～2.0 mg/mL時，XPC對超氧陰離子的清除率隨樣品濃度的增高而增大；當樣品濃度為2.0 mg/mL時，XPC對超氧陰離子的清除率高達30.95%，比Xyl的高37.20%。XPC對清除羥基自由基的能力隨樣品濃度的增高而增大，當樣品濃度為2.0 mg/mL時，其對羥基自由基的清除率為22.72%，比Xyl的高26.36%。當樣品濃度為0.1～2.0 mg/mL時，Xyl和XPC均具有一定的還原能力，隨著樣品濃度的增高其還原能力不斷增強，但變化不明顯，與文獻[28]中大分子量的水溶性大豆多糖鐵還原能力相似。研究[28]表明，Xyl自身具有一定的抗氧化活性，與三價鐵離子螯合后，其抗氧化活性顯著增加，可能與三價鐵與Xyl共軛引起的結構和分子量的變化有關。據報道[27]，相較于多糖自身，合成的平貝母多糖鐵配合物抗氧化活性顯著增加，與試驗結果相似，可能是Xyl結構中的羥基與三價鐵離子螯合形成復合物，使其抗氧化活性增強[29]。

圖4 FeCl3、Xyl及XPC的X-射線衍射圖譜

Figure 4 The X-ray diffraction patterns of FeCl3, Xyl and XPC

圖5 XPC的抗氧化活性

3 結論

以木聚糖為原料，與FeCl3螯合形成木聚糖—鐵復合物，通過響應面法優化以確定木聚糖—鐵復合物的制備工藝。結果表明，最佳制備木聚糖—鐵復合物的工藝條件為木聚糖與檸檬酸鈉質量比3∶1，制備溫度70 ℃，pH 8.0，木聚糖—鐵復合物得率為66.35%，含鐵量為22.57%。紅外光譜和X-射線衍射分析表明Fe3+成功與木聚糖螯合，形成了穩定的復合物，結構呈無定形狀態。木聚糖分子中存在大量的羥基，由于與鐵離子螯合，木聚糖—鐵復合物的抗氧化活性明顯高于木聚糖。后續可采用動物試驗進一步研究木聚糖—鐵復合物的毒性和生理功能特性，對木聚糖—鐵復合物能否開發為一種新型補鐵劑具有重要意義。