Bacillus stearothermophilus 麥芽糖淀粉酶在Bacillus subtilis 中的重組表達及發酵優化

李雨桐， 宿玲恰， 吳 敬， 吳 丹

（1. 食品科學與技術國家重點實驗室， 江南大學， 江蘇 無錫214122；2. 江南大學 生物工程學院， 江蘇 無錫214122；3. 江南大學 教育部食品安全國際合作聯合實驗室，江蘇 無錫214122）

麥芽糖淀粉酶（Maltogenicamylases，EC3.2.1.133），是糖苷水解酶13 家族中的一員[1]，可以催化麥芽三糖、淀粉和糊精中（1→4）-α-D-糖苷鍵的水解，通常在外部隨機水解，也可進行內部水解[2]。 除了水解作用外，麥芽糖淀粉酶還催化轉糖基作用的進行[3]。 麥芽糖淀粉酶在淀粉糖化工業、食品烘焙、面粉工業中的應用廣泛[4]。 特別是麥芽糖淀粉酶能夠減少支鏈淀粉的老化，在烘培工業中可作為抗老化劑水解淀粉生成麥芽糖和部分糊精，延長烘焙食品的貨架期[2,5]，減少食品的浪費。

麥芽糖淀粉酶來源眾多， 包括地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）[6]、嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus）[7]、嗜熱放線菌（Thermus vulgaris）[8]等。 目前，研究者主要將麥芽糖淀粉酶在大腸桿菌或枯草芽孢桿菌中異源表達[9]，但因為大腸桿菌在生長產酶的過程中會產生內毒素等， 是一種致病菌，對人體不利，限制了其應用。 而枯草芽孢桿菌是一種非致病的土壤微生物，已被美國食品藥物管理局以及中國相關部門認定為是一種食品安全級菌株GRAS（Generally recognized as safe）。 且其具有良好的蛋白質合成和分泌能力、 清楚的分子遺傳背景、較為成熟的發酵工藝，是工業生產酶制劑的典型菌株，因此以枯草芽孢桿菌為宿主進行麥芽糖淀粉酶的生產具有很大優勢[10-11]。

目前已有多篇報告研究了不同來源的麥芽糖淀粉酶在枯草芽孢桿菌中的異源表達。 1984 年，位于日本的Outtrap 團隊首次以枯草芽孢桿菌為宿主克隆表達了來源于B. stearothermuphilus的麥芽糖淀粉酶，并對其性質和應用都做了初步的探究[12]。更有全球工業酶制劑主導企業諾維信公司，推出了主打產 品“Novamyl”，是B. stearothermuphilus麥芽糖淀粉酶以枯草芽孢桿菌為宿主，經深層發酵以及蛋白質純化制成[13]。沈微等人在地衣芽孢桿菌麥芽糖淀粉酶5′端添加地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因信號肽后轉化枯草芽孢桿菌，最終發酵上清液酶活為5.9 U/mL[14]。2016 年，柳梅梅等人以pHCMCO4-Pglv 為載體，重組構建綠色糖單孢菌麥芽糖淀粉酶基因并轉入枯草芽孢桿菌中表達，胞外酶活可達257 U/mL[15]。 楊韻霏等人則實現了地衣芽孢桿菌麥芽糖淀粉酶在枯草芽孢桿菌中的高效異源表達，酶活高達296.64 U/mL[10]。

有研究表明，氮源、碳源的種類和濃度對枯草芽孢桿菌表達目的產物的多少具有很大的影響，在高密度補料分批發酵過程中，補料的碳源、氮源對菌體生長及產物的產生也都有著重要的影響[16-17]。

來源于嗜熱脂肪芽孢桿菌的麥芽糖淀粉酶在細菌麥芽糖淀粉酶中其溫度穩定性最好，80 ℃保溫35 h 后仍有50%的酶活力，在麥芽糖漿制備和抗面包老化中應用性能良好[17-18]。 本研究將嗜熱脂肪芽孢桿菌來源的麥芽糖淀粉酶在枯草芽孢桿菌中進行克隆表達；對麥芽糖淀粉酶進行搖瓶發酵的氮源種類、氮源質量濃度、碳源質量濃度等條件進行優化，確定其最佳產酶條件；對其最適溫度、最適pH、Km及比活等酶學性質進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒 菌株Escherichia coliJM109 和Bacillus subtilisCCTCC M 2016536、質粒pHY300PLK（帶有amyE 啟動子與YvcE 信號肽）和opt-amyM/T：作者所在實驗室保藏。

1.1.2 酶與主要試劑 In-Fusion HD Cloning Plus kit 試劑盒、Primer Star Taq DNA 聚合酶、dNTPs、四環素、氨芐抗生素：均購自Takara 公司；質粒抽提試劑盒、DNA 純化試劑盒、DNA 回收試劑盒： 均購自北京康為世紀生物科技有限公司；蛋白胨、酵母粉：購自英國Oxiod 公司；其他試劑如氯化鈉、甘油等：均購自國藥集團；引物：購自上海睿迪生物科技有限公司。

1.1.3 培養基 Luria-Bertani（LB）液體培養基（g/L）：酵母粉5.0，蛋白胨10.0，氯化鈉10.0。

LB 固體培養基： 在LB 液體培養基中加入1.5～2.0 g/dL 的瓊脂糖。

Terrifie Broth（TB）培養基（g/L）：酵母粉24.0，蛋白 胨12.0， 甘 油5.0，KH2PO42.31，K2HPO4·3H2O 16.43。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 以質粒opt-amyM/T為模板，按照In-Fusion HD Cloning Plus kit 試劑盒要求的同源臂引物設計原則設計引物如下：F1：5’-AAAACT GCATCGGCGTCTTCTTCTGCAAGCGTTAAA-3’，R1：5’-TTTATTACCAAGCTTTTAGTTCTGCCAAGTCAC AGTAATG-3’。 以pHY300PLK 載體質粒為模板，以同源臂引物設計原則為準則，設計引物如下：F2：5’-AAGCTTGGTAATAAAAAAACA-3’，R1：5’-CGCCG ATGCAGTTTTACTTG-3’。

1.2.2 運用PCR 擴增獲得目的基因與表達載體 以質粒opt-amyM/T為模板，正反向引物為F1/R1 擴增amyM 基因片段。PCR 的參數為：預變性94 ℃5 min，變性98 ℃10 s，退火55 ℃15 s，延伸72 ℃2 min 10 s，30 個循環；保存：72 ℃10 min，之后存放于4 ℃。

質粒pHY300PLK 作為為模板， 正反向引物為F2/R2 擴增表達載體片段。 進行PCR 的參數為：預變性94 ℃5 min，變性98 ℃10 s，退火55 ℃15 s，延伸72℃6 min，30 個循環； 保存：72 ℃10 min，之后存放于4℃。

1.2.3 連接與鑒定 目的基因與表達載體經過PCR 擴增及核酸膠跑膠回收， 根據In-Fusion@HD Cloning Kit 試劑盒要求， 按照插入片段和載體的摩爾比例為2∶1 進行混合。 連接體系中連接酶5X In-Fusion HD Enzyme Premix 為2 μL，插入片段和載體經回收后測出DNA 濃度，計算加入量，最后用dH2O補齊總體系至10 μL。 連接完畢后將連接產物轉入E.coliJM109 感受態細胞。

培養后涂布含100 μg/mL 氨芐抗生素的LB 固體平板，37 ℃培養過夜。 待單菌落長出后，于LB 液體培養基中挑入單菌落培養8~10 h，收集菌體抽提質粒，分別用F1/R1 與F2/R2 為引物并以此質粒為模板進行PCR 驗證，驗證正確后送至生工生物工程有限公司進行測序， 測序正確后轉入表達宿主Bacillus subtilisCCTCC M 2016536 感受態細胞中，培養后涂布含20 μg/mL 四環素抗性的LB 固體培養基中，于37 ℃恒溫培養箱中過夜培養8~10 h，待單菌落長出后于液體LB 中挑入單菌落并培養8~10 h，保存至甘油管中（甘油終體積分數15%）并收集菌體抽提質粒， 用1.2.1 中引物進行PCR 驗證正確后確定轉入表達宿主中。

1.2.4 搖瓶發酵 從甘油管中以2%的接種體積分數接種入LB 液體培養基中（含20 μg/mL 四環素抗性），37 ℃、200 r/min 培養8~10 h。 以5%接種體積分數至TB 培養基中，在37 ℃培養2 h 后轉入33 ℃培養48 h。 發酵完畢后離心10 min，棄去菌體沉淀，轉速為12 000 r/min，取發酵上清液即為酶液。

1.2.5 麥芽糖淀粉酶活力的測定及蛋白質檢測酶活測定方法使用DNS 法[12]，配置1%的可溶性淀粉溶液，取1 mL 于試管中，加入50 mmol/L、pH 5.5的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液900 μL， 于60 ℃預熱10 min 后加入100 μL 酶液反應10 min，反應以加入3 mL DNS 進行終止，在100 ℃沸水中煮沸7 min 進行顯色， 冷卻后加入10 mL 水至終體積為15 mL，于540 nm 處測量吸光值。 麥芽糖淀粉酶酶活單位定義為：在上述條件下，每分鐘催化產生相當于1 μmol葡萄糖所需的酶量為一個淀粉水解活力單位[9]。 使用SDS-PAGE 對麥芽糖淀粉酶進行檢測。

1.2.6 菌濃（OD600）的測定 用分光光度計在600 nm處進行吸光值的測量， 此時應將發酵液稀釋得當，菌濃（OD600）=稀釋倍數×600 nm 處的度數。

1.2.7 搖瓶發酵中培養基、培養條件對重組菌產酶的影響 考察多種酵母粉、工業蛋白胨、大豆蛋白胨、棉籽粉、玉米漿、酵母浸膏6 種氮源、酵母浸膏和大豆蛋白胨的氮源復配對產酶的影響。 氮源分別為5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0 g/L；甘油、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、玉米糊精6 種碳源，分別為1.0，5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 g/L； 初始pH 分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5；發酵溫度分別為33、37、41、45、49 ℃。

1.2.8 對麥芽糖淀粉酶進行純化 為進一步對麥芽糖淀粉酶進行性質分析，因此對麥芽糖淀粉酶進行純化。 通過熱處理、硫酸銨沉淀、過夜透析、Mono QTM10/100 GL 陰離子交換色譜柱過柱后，麥芽糖淀粉酶可以達到電泳純。

1.2.9 麥芽糖淀粉酶酶學性質研究

1）最適反應pH 的研究：在60 ℃下，分別測定在 不 同pH 緩 沖 溶 液（2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5） 配制的可溶性淀粉底物中的水解酶活力，以測得的最高酶活力值為100%，計算相對酶活力，確定最適的反應pH。

2）最適反應溫度的研究：在最適pH 的條件下，分別測定在不同溫度（30、40、50、60、70、80、90 ℃）下麥芽糖淀粉酶的淀粉水解活力，以測得的最高酶活為100%，計算相對酶活力，確定最適反應溫度。

3）在最適溫度下麥芽糖淀粉酶半衰期的測定：將麥芽糖淀粉酶置于最適反應溫度下，每過一段時間取樣，測量酶活，以未處理的酶活力為100%，計算在最適反應溫度下酶的半衰期。

4）麥芽糖淀粉酶動力學參數的測定：用最適反應pH 緩沖液配制可溶性淀粉底物， 于最適反應溫度下進行酶活的測量。 在上述條件下，配制不同濃度的可溶性淀粉溶液，分別測定麥芽糖淀粉酶初始水解活力，采用GraphPad Prism 5.0 軟件，得到米氏（Michaelis-Menten）方程，計算得到Kcat值。

5）麥芽糖淀粉酶比活力的測定：在最適反應條件下測定純化后麥芽糖淀粉酶酶活，采用考馬斯亮藍染色（Bradford）法測定純化后酶的蛋白質含量，計算麥芽糖淀粉酶比活力。

2 結果與分析

2.1 重組菌的構建與搖瓶發酵

以質粒opt-amyM/T為模板， 用PCR 儀擴增amyM基因。以質粒pHY300PLK（帶有amyE 啟動子與YvcE 信號肽）為模板，用PCR 儀擴增出表達載體片段。 擴增出的目的基因及表達載體產物用1.0 g/dL的瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的基因與表達載體片段大小分別約為2 100、5 900 bp。 驗證正確后用1.0 g/dL的瓊脂糖凝膠進行分離回收。 目的基因片段與表達載體片段用In-Fusion 連接酶連接后轉入E.coliJM109 感受態細胞中， 培養并涂布于固體LB 平板上，過夜培養后挑單菌落于LB 液體培養基中，培養8~10 h 后抽提質粒，PCR 驗證正確后將質粒送于測序公司， 序列驗證正確后轉入表達宿主B.subtilisCCTCC M 2016536 中，培養后涂布LB 平板，挑單菌落于LB 液體培養基中，培養后抽提質粒進行驗證，確定重組菌株構建成功， 保菌于15%甘油管中，見圖1。

圖1 麥芽糖淀粉酶瓊脂糖凝膠電泳分析Fig. 1 Agarose gel electrophoresis analysis of maltogenic amylases

重組菌進行搖瓶發酵，48 h 后發酵完畢， 離心取發酵上清液即為麥芽糖淀粉酶酶液， 對發酵上清液進行SDS-PAGE 分析，見圖2。 相對分子質量69 000附近出現明顯的特異性蛋白質條帶， 為麥芽糖淀粉酶理論相對分子質量。 測定重組菌胞外酶活力為250.7 U/mL。

圖2 麥芽糖淀粉酶蛋白質電泳分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of maltogenic amylases

2.2 搖瓶發酵優化

2.2.1 氮源種類對重組菌生長和產酶的影響 分別以酵母粉、工業蛋白胨、大豆蛋白胨、棉籽粉、酵母浸膏及玉米漿代替TB 培養基中的酵母粉和蛋白胨進行氮源優化。固定其質量濃度為15 g/L，其他培養基中成分不變，按1.2.4 進行發酵產酶，見圖3。采用酵母浸膏作為氮源時，48 h 胞外酶活最高可達315.68 U/mL， 但此時菌體濃度最低， OD600只能達到3.8 左右； 而大豆蛋白胨作為培養基中惟一氮源時，酶活只能達到270.64 U/mL，但是此時菌體濃度能達到5.8 左右， 是這幾種氮源中最能促進菌體生長的氮源。

圖3 氮源種類對重組菌生長和產酶的影響Fig. 3 Effects of various nitrogen sources on biomass and maltogenic amylases production

2.2.2 氮源復配對重組菌生長和產酶的影響 以總氮源為15 g/L，分別以酵母浸膏7.5 g/L 與同樣質量濃度的酵母粉、工業蛋白胨、大豆蛋白胨、棉籽粉及玉米漿作為復合氮源。 如圖4 所示，當酵母浸膏與大豆蛋白胨進行復配后，48 h 胞外酶活最高可達329.67 U/mL，且其OD 為4.5，因此采用酵母浸膏與大豆蛋白胨復合氮源作為重組菌的氮源。

圖4 氮源復配對重組菌生長和產酶的影響Fig. 4 Effect of nitrogen source compounding on biomass and maltogenic amylases production

2.2.3 復配時大豆蛋白胨與酵母浸膏的質量濃度對菌體生長和產酶影響 因酵母浸膏對菌體產酶影響最大， 因此首先以5 g/L 大豆蛋白胨分別與5、10、15、20、25、30 g/L 酵母浸膏進行復配作為總氮源進行搖瓶發酵，見圖5。隨著酵母浸膏質量濃度的升高，菌體生長也不斷增加。 在酵母浸膏質量濃度為15~25 g/L 之間時， 菌體產酶最為適宜且相差不大，但氮源質量濃度在25 g/L 以下時菌體生長不好，因此以25 g/L 酵母浸膏為最適。 在此基礎上，以25 g/L酵母浸膏分別與1、5、10、15、20、25、30 g/L 大豆蛋白胨進行復配作為總氮源進行搖瓶發酵，見圖6。隨著大豆蛋白胨質量濃度的升高， 菌體生長更加良好， 但是當大豆蛋白胨的質量濃度超過15 g/L 時，菌體生長開始出現下降趨勢，菌體的生長反而受到了抑制，可能是因為氮源的質量濃度過高導致。 而菌體產酶隨著大豆蛋白胨質量濃度的升高而降低，其中以5 g/L 大豆蛋白胨最佳。 因此以25 g/L 酵母浸膏與5 g/L 大豆蛋白胨作為培養基中的復合氮源，酶活可達345 U/mL。

圖5 復配時酵母浸膏的質量濃度對菌體生長和產酶影響Fig. 5 Effect of yeast extract concentration on biomass and maltogenic amylases production

圖6 復配時大豆蛋白胨的質量濃度對菌體生長和產酶影響Fig. 6 Effect of soy peptone concentration on biomass and maltogenic amylases production

2.2.4 碳源種類對重組菌和產酶的影響 選擇2.2.3 中優化出的復合氮源作為培養基中的氮源，以5 g/L 的甘油、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、玉米糊精分別作為培養基中惟一碳源進行搖瓶發酵，結果見圖7。以葡萄糖或甘油為碳源時，菌體的生長濃度及產酶都很相近，而其他種類的碳源產酶均低于這兩種碳源，表明葡萄糖和甘油對枯草芽孢桿菌的生長和產酶均具有良好的作用。 而在甘油和葡萄糖中，以甘油為惟一碳源時菌體產酶最佳，最高酶活為345.7 U/mL。

圖7 碳源種類對重組菌和產酶的影響Fig. 7 Effect of various carbon source on biomass and maltogenic amylases production

2.2.5 碳源質量濃度對重組菌和產酶的影響 以甘油為培養基中惟一碳源進行最佳碳源質量濃度的探究。 以優化好的復合氮源作為惟一氮源，分別以1、5、10、15、20、25 g/L 的甘油作為培養基中惟一碳源，結果見圖8。菌體的生長濃度顯示不同碳源質量濃度對其影響并不大，但是隨著甘油質量濃度的升高，菌體產酶逐漸下降，推測枯草芽孢桿菌在低質量濃度碳源下更利于產酶，以5 g/L 的甘油為最佳。

圖8 碳源質量濃度對重組菌和產酶的影響Fig. 8 Effect of carbon source concentration on biomass and maltogenic amylases production

2.2.6 初始pH 對重組菌生長和產酶的影響 確定了培養基中的氮源和碳源后，為了進一步優化重組菌最適生長產酶條件， 確定初始pH 對重組菌的影響， 使用磷酸和氨水對初始培養基的pH 進行調整并進行搖瓶發酵。 如圖9 所示，隨著pH 的升高，菌體濃度逐漸下降，推測枯草芽孢桿菌在偏酸的環境中更易生長， 酶活在pH 6.5 處達到最高， 隨著pH的升高或者降低都逐漸降低， 因此確定最佳初始pH 為6.5，此時麥芽糖淀粉酶胞外酶活為357.7 U/mL。

圖9 初始pH 對重組菌生長和產酶的影響Fig. 9 Effect of initial pH on biomass and maltogenic amylases production

2.2.7 溫度對重組菌生長和產酶的影響 培養溫度對菌體生長和產酶過程都具有很大的影響， 適宜的溫度會使菌體保持良好的活力， 促進菌體產酶。 用上述優化好的條件，研究溫度對重組菌的影響。 如圖10 所示，研究33、37、41、45、49 ℃下重組菌生長和產酶情況。 隨著溫度的升高，菌體的生長濃度逐漸降低，可見在高溫下，菌體生長情況并不良好。 但是隨著溫度升高， 菌體產酶逐漸增加，在41 ℃達到最佳，為396 U/mL；隨后逐漸下降，在49 ℃出現大幅度的下降， 因此確定41 ℃進行搖瓶發酵為最佳。

圖10 溫度對重組菌生長和產酶的影響Fig. 10 Effect of temperature on biomass and maltogenic amylases production

2.3 麥芽糖淀粉酶酶學性質的鑒定

2.3.1 最適反應pH 的研究 將麥芽糖淀粉酶置于不同pH （2.5~8.5）緩沖液中測定酶活力。 如圖11 所示， 麥芽糖淀粉酶在pH 3.5~7 之間均保有60%以上的酶活力。低于3.5 及高于7 時，酶活力迅速下降，在pH 5.5 時最適。表明麥芽糖淀粉酶的適應pH 范圍較廣，且在偏酸環境下更為適宜。

圖11 最適反應pH 值Fig. 11 Optimal pH

2.3.2 最適反應溫度的研究 將麥芽糖淀粉酶置于pH 5.5 下，于不同溫度（30~90 ℃）中測量酶活，結果見圖12。 60 ℃為最適反應溫度，50~80 ℃下均保留有80%以上的酶活， 且低于40 ℃時酶活較大幅度下降。 由此可見，麥芽糖淀粉酶的適應溫度范圍較廣，且更適宜于高溫。

圖12 最適反應溫度Fig. 12 Optimal temperature

2.3.3 最適溫度下的麥芽糖淀粉酶半衰期的測定將麥芽糖淀粉酶置于60 ℃水浴鍋中， 每隔一段時間取樣測量酶活， 以確定麥芽糖淀粉酶的半衰期，見圖13。麥芽糖淀粉酶在60 ℃下，半衰期高達325 h 之久，十分穩定。

圖13 重組麥芽糖淀粉酶的溫度穩定性Fig. 13 Temperature stability of recombinant maltogenic amylase

2.3.4 對麥芽糖淀粉酶的動力學參數及比酶活的測量 用麥芽糖淀粉酶最適pH 緩沖液配制不同質量濃度的淀粉底物， 在最適反應溫度下進行反應，測量麥芽糖淀粉酶的動力學參數，Km為0.95 g/L，比酶活為2 646 U/mg。 通過一系列純化操作，將麥芽糖淀粉酶進行純化，見圖14，可見麥芽糖淀粉酶已純化至電泳純。

圖14 麥芽糖淀粉酶純化至電泳純Fig. 14 Purification of maltogenic amylase

在最適條件下測量純化后麥芽糖淀粉酶酶活，并用考馬斯亮藍測定其蛋白質含量，得到麥芽糖淀粉酶比酶活。

3 討 論

麥芽糖淀粉酶在麥芽糖漿的制備中有很好的作用，其具有多底物特異性，對于麥芽三糖、淀粉及一些寡糖均具有水解作用[20]。 近年來隨著烘焙食品的逐漸發展，烘焙食品的貯藏周期短是急需要解決的一個問題。

由于TB 培養基營養豐富， 較為適合枯草芽孢桿菌發酵生產外源蛋白質[19]，所以在TB 培養基基礎上進行發酵優化。 在本研究中，酵母浸膏和大豆蛋白胨分別作為單一氮源時， 前者有菌體濃度不高、后者有酶活方面略差的缺點，因此使用酵母浸膏與大豆蛋白胨作為復合氮源。 相比較初始搖瓶培養溫度，重組菌在41 ℃產酶最好，酶活最高，可能因麥芽糖淀粉酶來自于嗜熱脂肪芽孢桿菌，本身在高溫下酶的折疊性較低溫下好。

經酶學性質的研究，發現枯草芽孢桿菌中表達的麥芽糖淀粉酶比在大腸桿菌中的適應pH 范圍和溫度范圍都更加廣泛，實際應用時更有優勢。 在烘焙食品方面，除了麥芽糖淀粉酶，還有一些淀粉酶也可以水解淀粉生成麥芽糖及糊精，但是其最適溫度都存在過低或過高使得在加工過程中及加工過程后滅活的過程中出現問題。 而麥芽糖淀粉酶的最適溫度處于一個較為適宜的水平，既不會因為加工過程中溫度較高而失活， 又能在加工后被有效滅活，不引起淀粉的過度分解致使面團發黏，因此其抗淀粉老化能力較好，可以有效地保持面包的彈性及新鮮程度。 盡管麥芽糖淀粉酶在大腸桿菌中的表達可高達4 379 U/mL[9]，但是以大腸桿菌為宿主發酵生產的麥芽糖淀粉酶不宜用于食品工業，枯草芽孢桿菌作為一個具有安全性及分泌潛力的宿主菌，對產生麥芽糖淀粉酶并用于食品烘焙行業是非常具有競爭力的。

作者采用B.stearothermophilus來源的麥芽糖淀粉酶基因在枯草芽孢桿菌中進行表達，通過優化重組菌的發酵條件，確定了麥芽糖淀粉酶搖瓶發酵的最佳培養基及溫度等，同時對麥芽糖淀粉酶的酶學性質及動力學參數進行了簡單的測量，為其在食品行業的應用奠定了基礎。

4 結 語

將B.stearothermophilus來源的麥芽糖淀粉酶基因在枯草芽孢桿菌中進行克隆表達， 在TB 培養基中搖瓶發酵48 h 后， 麥芽糖淀粉酶活力可達250.7 U/mL。 在此基礎上對重組菌搖瓶發酵條件進行優化，確定重組菌發酵最適宜條件為：氮源（酵母浸膏25 g/L，大豆蛋白胨5 g/L）30 g/L、甘油5 g/L、初始pH 6.5、培養溫度41 ℃。 最佳發酵條件下麥芽糖淀粉酶酶活可達396 U/mL。測定麥芽糖淀粉酶最適反應溫度為60 ℃、最適pH 為5.5，麥芽糖淀粉酶的反應溫度和pH 的適應范圍都很廣泛、在60 ℃下半衰期為325 h、動力學參數Km為0.95 g/L、比活為2 646 U/mg，在食品等工業上都具有良好的應用前景。