液相色譜-串聯質譜法快速測定豬肝臟中恩拉霉素殘留量

張 艷，付 巖，吳銀良

(寧波市農業科學研究院，浙江 寧波 315040)

恩拉霉素(Enramycin)是1966年由日本武田藥品研究所發現的一株殺真菌素鏈霉菌(StreptomycesfungicidicusNo.B5477)經發酵獲得的次級代謝產物，屬于多肽類抗生素。恩拉霉素的主要成分有恩拉霉素A和恩拉霉素B，此外還有少量的恩拉霉素C和恩拉霉素D[1]。動物使用后，能改善腸道內的細菌群，可促進豬、雞增重和提高飼料轉化率，且具有低毒、低殘留特性，2005年在國內開始獲批生產使用[1]。該藥物是少數幾種可用于飼料添加的抗生素之一，但生產中為追求效益往往超量使用，一方面損傷動物的臟器組織[2]，另一方面勢必造成其在動物產品中殘留量增加。目前我國GB 31650-2019《食品中獸藥最大殘留限量》和原農業部第235號公告均未規定恩拉霉素在動物可食性組織中的最大殘留量(MRL)[3-4]，但日本規定了恩拉霉素在豬、雞的可食性組織(肌肉、肝臟、腎臟和脂肪)中的MRL為30 μg/kg[5]。為保障我國動物性食品安全和促進國際貿易，迫切需要建立快速準確的動物性食品中恩拉霉素的檢測方法。

目前已建立的生物材料中恩拉霉素的分析方法相對較少，分析對象主要為飼料，少數為動物性食品，分析手段有微生物法[6-7]、薄層色譜法[8]、液相色譜法[9]和液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)[5,10-11]；恩拉霉素人工抗原方面的研究亦有一定報道[12-13]，但未見相關免疫分析方法的報道。而動物性食品中恩拉霉素的分析方法多為液相色譜-串聯質譜法，分析對象為雞肉[5,10]和豬肉[11]，待測物均為恩拉霉素A和恩拉霉素B，目前尚未見有關動物肝臟中恩拉霉素的分析方法報道；所建方法均采用固相萃取進行凈化，凈化小柱有Waters Oasis HLB、Agilent Bond Elut ENV以及IRISTMPolymeric SPE，前處理較復雜，且Boison等[5]建立的方法對雞肉中恩拉霉素A和恩拉霉素B的定量下限分別為66 μg/kg和50 μg/kg，無法滿足相關殘留限量的要求。本研究利用恩拉霉素易溶于稀鹽酸的特點，建立了稀鹽酸-乙腈混合溶液提取，有機溶劑液液萃取凈化，LC-MS/MS分析豬肝臟中恩拉霉素的方法。該方法具有簡單、快速、準確和靈敏的特點，能滿足相關殘留監控的需要。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters UPLC超高效液相色譜儀、XevoTMTQ-S micro串聯質譜儀(美國Waters公司)，配置電噴霧離子源；Ultra-Tyrrax T25型勻質器(德國IKA公司)；低溫高速離心機(德國Sigma公司)。

恩拉霉素A和恩拉霉素B均由安徽普洛生物科技有限公司提供，含量分別為98.6%和92.3%。甲醇、乙腈(色譜純，德國Merck公司)；甲酸(色譜純，美國Tedia公司)；鹽酸、乙酸乙酯和正己烷(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；實驗用水為Milli-Q超純水。

1.2 色譜及質譜條件

色譜條件：色譜柱為Acquity BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相：A相為0.1%甲酸溶液，B相為甲醇；流速：0.3 mL/min；進樣量：10 μL；梯度洗脫條件：在0.5 min內保持80%A，然后在2.5 min內線性降至25%A，保持2 min后在0.1 min內線性升至80%A，保持1.9 min。

質譜條件：離子源為電噴霧電離源(ESI)，正離子模式電離；檢測方式為多反應監測(MRM)；毛細管電壓為2.0 kV；萃取錐孔電壓為25 V；RF透鏡電壓為0.5 V；離子源溫度為150 ℃；脫溶劑氣溫度為500 ℃；錐孔氣流速為50 L/h；脫溶劑氣流速為1 000 L/h；其它條件見表1。

表1 恩拉霉素A和恩拉霉素B的保留時間、母離子、子離子、錐孔電壓及碰撞能量Table 1 Retention times,precursor ions，product ions，cone voltages and collision energies of enramycin A and enramycin B

*quantitative ion

1.3 樣品前處理

稱取試樣2.5 g(精確至0.01 g)于50 mL離心管中，加入10 mL 0.1 mol/L鹽酸-乙腈(3∶7，體積比)，以10 000 r/min均質1 min，再以9 500 r/min離心5 min后，取上清液，相同條件下重復提取1次，合并提取液，依次加入8 mL乙酸乙酯和2 mL正己烷，渦旋1 min后以5 000 r/min離心2 min，取下層水相(約6.5 mL)，用0.1%甲酸定容至10 mL，過0.22 μm濾膜后，供LC-MS/MS測定。

1.4 加標回收實驗

利用經測定不含恩拉霉素的豬肝臟樣品進行加標實驗，樣品處理與“1.3”方法相同，恩拉霉素A和恩拉霉素B的加標濃度為15、30、60 μg/kg。樣品稱樣后加入標準溶液，渦旋混勻放置0.5 h后進行樣品處理。

1.5 精密度實驗

按照“1.4”進行空白加標實驗，每一加標濃度進行3批次實驗，每批次5個平行樣品，計算批內相對標準偏差(RSD)及批間RSD。

2 結果與討論

2.1 儀器條件的優化

多肽類抗生素因結構上含有氨基基團而在正離子模式下易帶正電荷，且易帶2個或3個電荷[5]。本實驗用0.1%甲酸溶液-甲醇(80∶20，體積比)分別配制1.0 mg/L的恩拉霉素A和恩拉霉素B單標溶液，發現相同條件下恩拉霉素A和恩拉霉素B帶3個電荷的準分子離子峰的響應分別約為帶2個和4個電荷準分子離子峰響應的50倍和10倍，因此優化得到帶3個電荷的準分子離子峰的質譜條件(表1)。其中定量離子對(m/z786.0>95.0和m/z790.8>95.0)與文獻報道相同[5,10-11]，本方法選擇的定性離子為m/z1 089.0，與文獻[5]中恩拉霉素B的定性離子一致。

采用超高效液相色譜常用的Acquity BEH C18柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)在“1.2”的梯度條件下，對比了水相中甲酸濃度為0.1%、0.2%和0.4%，有機相為甲醇或乙腈時恩拉霉素A和恩拉霉素B的分離效果，發現恩拉霉素A和恩拉霉素B在甲酸為0.1%時的響應和信噪比均最好；且有機相為甲醇時，恩拉霉素A和恩拉霉素B的響應比有機相為乙腈時高70%左右，信噪比約高40%，因此確定以0.1%甲酸溶液-甲醇為流動相。

圖1 不同體積比0.1 mol/L鹽酸和乙腈混合溶劑對恩拉霉素提取回收率的影響(加標200 μg/kg)Fig.1 Effects of different volume ratio for 0.1 mol/L HCl- acetonitrile on recoveries of enramycin (added 200 μg/kg) volume ratio of 0.1 mol/L HCl to acetonitrile(1-5):5∶5, 4∶6,3∶7,2∶8,1∶9,respectively

2.2 前處理條件的優化

目前多肽類抗生素常用的提取劑有甲醇[14]、甲醇-水[5,15-16]、鹽酸-乙腈[10-11]等。而恩拉霉素易溶于鹽酸，因此本研究按照“1.3”的方法對比了不同比例0.1 mol/L鹽酸和乙腈混合溶劑的提取效果(圖1)，發現0.1 mol/L鹽酸和乙腈的體積比為3∶7、4∶6和5∶5時的提取回收率均高于92.0%，且差異較小；同時經研究發現乙腈比例越高，基質效應越小，因此本研究采用0.1 mol/L鹽酸-乙腈(3∶7)作為提取溶劑。

對于動物性食品中多肽類抗生素的凈化目前多采用固相萃取法，萃取小柱主要有HLB、PLS、Strata-X、Bond Elut ENV和IRISTMPolymeric SPE等[5,10-11,14-16]。考慮到恩拉霉素易溶于鹽酸，本研究嘗試在提取液中加入有機溶劑采用液液萃取凈化提取液，結果發現按“1.3”步驟得到的加標樣品提取液中加入8 mL乙酸乙酯渦旋后，水相和有機相分層較好，但由于分層后水相體積較少(約2.5 mL)，回收率(n=3)只有(42±2)%左右；而固定加入8 mL乙酸乙酯，同時加入不同體積(1、2、3 mL)正己烷時的回收率(n=3)分別為(65±3)%、(83±4)%和(82±4)%。當正己烷體積從1 mL增至2 mL時，上層溶液的極性逐漸變弱而導致更多水從上層析出，下層水相體積從2.5 mL增至6.5 mL左右，最終導致回收率逐漸增加；當正己烷體積從2 mL增至3 mL時，下層水相體積基本不變，回收率變化也較小，因此選擇加入2 mL正己烷。同時對直接提取進樣、液液萃取、ENV固相萃取凈化(按“1.3”提取，氮吹至無有機相后按文獻[10]操作)的基質效應(以基質標準曲線斜率和溶劑標準曲線斜率之比表示)進行研究，發現液液萃取凈化的基質效應得到了明顯改善，與固相萃取凈化的基質效應差異較小，但操作更加簡單快速，且空白樣品無雜質干擾(圖2A)；同時最終上樣溶液經樣品提取凈化等步驟處理后，含鹽酸濃度約為0.06 mol/L，且僅作為進樣溶液未作為流動相，大量進樣(方法研究和實際樣品分析)后未發現對ESI源的噴霧電流和ESI污染有明顯影響，因此采用加入乙酸乙酯和正己烷液液萃取的方法進行樣品凈化。

2.3 線性實驗

在經“1.3”處理的空白樣品下層凈化液中加入適量恩拉霉素A和恩拉霉素B標準溶液，配制2.0、10、20、50、100、200、500 μg/L系列基質匹配標準工作溶液進行LC-MS/MS分析，以定量離子對峰面積(Y)對質量濃度(X，μg/L)作標準曲線。結果表明，恩拉霉素A和恩拉霉素B在2.0～500 μg/L范圍內呈良好的線性關系，回歸方程分別為Y=89.6X+205(r2=0.998 9)和Y=97.8X+189(r2=0.997 8)。

2.4 方法的回收率、相對標準偏差與檢出限

按照“1.4”和“1.5”方法進行加標和精密度實驗，結果表明，恩拉霉素A和恩拉霉素B的平均回收率為80.8%～90.3%，批內RSD為0.90%～4.5%，批間RSD為3.0%～4.3%。分別以信噪比S/N=3和S/N=10計算檢出限和定量下限，恩拉霉素A和恩拉霉素B在豬肝臟中的檢出限分別為3.0、4.0 μg/kg，定量下限分別為10、12 μg/kg(表2)。本方法的靈敏度與文獻[10]相當，明顯優于文獻[5]的方法靈敏度(恩拉霉素A和恩拉霉素B的定量下限分別為66、50 μg/kg)；同時本方法操作更簡便，單個樣品從前處理到分析僅需0.5 h左右，比現有方法耗時短(通常需1.5～3 h)。空白豬肝臟樣品的加標回收MRM色譜圖見圖2B。

表2 豬肝臟中恩拉霉素的平均回收率、相對標準偏差、檢出限和定量下限Table 2 Average recoveries,relative standard deviations(RSD),the limits of detection(LOD) and the limits of quantitation(LOQ) of enramycin in swine liver

圖2 空白豬肝臟樣品(A)和加標樣品(B，15 μg/kg)的MRM色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of swine liver blank sample(A) and fortified sample(B,15 μg/kg)

2.5 方法應用

采用優化后的樣品前處理方法和分析條件分別對采自寧波當地大型超市的22個豬肝臟樣品進行了分析，均未檢出恩拉霉素A和恩拉霉素B。

3 結 論

通過優化樣品提取和儀器條件，建立了豬肝臟樣品中恩拉霉素A和恩拉霉素B同時分析的液相色譜-串聯質譜方法。樣品經0.1 mol/L鹽酸-乙腈(3∶7)提取后，通過加入有機溶劑液液萃取凈化即可滿足分析要求。經方法驗證，恩拉霉素A和恩拉霉素B在15、30、60 μg/kg加標濃度下，平均回收率為80.8%～90.3%，批內RSD為0.90%～4.5%，批間RSD為3.0%～4.3%，檢出限分別為3.0、4.0 μg/kg，定量下限分別為10、12 μg/kg。該方法簡單實用，能夠滿足實際殘留監控的需要。