常用微生物培養(yǎng)有機質(zhì)對小球藻生長的影響

金衛(wèi)華，駱淑媛，丁奕丹，郭露寒，張 贇，唐紅楓，孫 茜

(1.武漢東湖學院生命科學與化學學院，湖北 武漢 430212；2.武漢東湖學院 生物醫(yī)用材料創(chuàng)新研究所，湖北 武漢 430212；3.湖北省疾病預(yù)防控制中心，湖北 武漢 430079)

小球藻營養(yǎng)豐富，含有蛋白質(zhì)、核酸、糖類、脂類和微量元素等多種生物活性物質(zhì)，具有顯著增強免疫、抗癌、抗病毒等作用[1-2]，廣泛應(yīng)用于食品與醫(yī)藥廢水處理。魚苗、蝦苗的飼料要求既能提供豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，又能增強苗種的免疫抗病能力，因此，小球藻在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域也有很高的應(yīng)用價值[3]。目前，關(guān)于小球藻快速繁殖技術(shù)的報道較多[4-10]，一般集中在無機鹽培養(yǎng)條件下的快速繁殖技術(shù)上，未見在有機質(zhì)(蛋白胨、酵母提取物和牛肉膏)培養(yǎng)條件下的快速繁殖技術(shù)研究。為此，作者選擇3種實驗室常用的微生物培養(yǎng)有機質(zhì)(蛋白胨、酵母提取物和牛肉膏)，研究其對小球藻生長的影響，以期找到一條短時間內(nèi)擴繁大量小球藻的途徑，為探索小球藻的營養(yǎng)利用方式提供依據(jù)。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

小球藻(Chlorellazofingensis)，武漢百意欣生物技術(shù)有限公司。蛋白胨、酵母提取物，Oxoid；牛肉膏，北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司。

檸檬酸，EDTA-Na2，檸檬酸鐵銨，NaNO3，K2HPO4，MgSO4·7H2O，CaCl2，Na2CO3，H3BO3，MnCl2·4H2O，ZnSO4·7H2O，Na2MnO4·2H2O，CuSO4·5H2O，Co(NO3)2·6H2O，均為國產(chǎn)分析純。

SPX-300B-G型光照恒溫培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；i3型紫外可見分光光度計，濟南海能儀器股份有限公司；AUY120型電子天平，日本SHIMADZU公司。

1.2 培養(yǎng)基的配制

參照文獻[11]配制BG-11培養(yǎng)基。

1.3 方法

取400 mL BG-11培養(yǎng)基置于500 mL透明錐形瓶中，分別按質(zhì)量梯度(0.0 g、1.0 g、2.0 g、3.0 g、4.0 g、5.0 g、6.0 g)加入121 ℃滅菌15 min的蛋白胨、酵母提取物和牛肉膏水溶液85 mL。在上述各錐形瓶中，無菌接種15 mL小球藻懸液(A680值為0.10)，用棉塞塞住瓶口，以防污染；置于光照培養(yǎng)箱中，于光照強度為4 500 Lux、溫度為25 ℃的條件下培養(yǎng)，每24 h取培養(yǎng)液(取培養(yǎng)液前后將錐形瓶置于25 ℃恒溫搖床中150 r·min-1振蕩15 min，保證小球藻分散均勻并充分和營養(yǎng)物質(zhì)接觸)，測定其A680值，觀察其生長情況。以未接種小球藻懸液的培養(yǎng)液(但含相應(yīng)濃度的有機質(zhì))為空白對照，培養(yǎng)液起始A680值均為0。

2 結(jié)果與討論

2.1 小球藻在以蛋白胨為有機質(zhì)的培養(yǎng)基中的生長趨勢(圖1)

從圖1可以看出，以蛋白胨為培養(yǎng)基有機質(zhì)時，隨著蛋白胨用量的增加，小球藻的生長速度逐漸加快。當?shù)鞍纂擞昧繛?.0 g時，小球藻在1～8 d的培養(yǎng)時間內(nèi)，能夠保持一定的生長速度，A680值逐漸升高，小球藻生長具有良好的穩(wěn)定性，有利于小球藻總量的累積；當?shù)鞍纂擞昧繛?.0 g時，培養(yǎng)1～5 d，小球藻生長速度最快，A680值快速升高，但繼續(xù)延長培養(yǎng)時間，小球藻生長速度減慢，A680值升高不明顯，說明過快的增殖代謝，導(dǎo)致一部分小球藻死亡，并不利于小球藻總量的累積；當?shù)鞍纂擞昧吭鲋?.0 g和6.0 g時，培養(yǎng)6 d后小球藻生長速度有所加快，蛋白胨用量為5.0 g時的累積量最高，且穩(wěn)步增長。表明，在500 mL培養(yǎng)基中，蛋白胨用量為5.0 g(質(zhì)量濃度1.00%)時，小球藻的生長情況最好。從節(jié)約成本考慮，蛋白胨用量為3.0 g(質(zhì)量濃度0.60%)是最經(jīng)濟的。

圖2為小球藻在以蛋白胨為有機質(zhì)的培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)2 d和8 d時的照片，從培養(yǎng)液顏色深淺來看，其結(jié)果與A680值(圖1)相符。

圖2 小球藻在以蛋白胨為有機質(zhì)的培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)2 d和8 d時的照片F(xiàn)ig.2 Photos of Chlorella zofingensis cultured with peptone as organic matter for 2 d and 8 d

2.2 小球藻在以酵母提取物為有機質(zhì)的培養(yǎng)基中的生長趨勢(圖3)

從圖3可以看出，以酵母提取物為培養(yǎng)基有機質(zhì)時，小球藻生長緩慢，且很不穩(wěn)定；培養(yǎng)5 d的累積量與以蛋白胨為有機質(zhì)時培養(yǎng)2～3 d的累積量相當；以不同用量的酵母提取物為培養(yǎng)基有機質(zhì)時均容易導(dǎo)致小球藻死亡，出現(xiàn)生長曲線下滑的情況，這可能與酵母提取物所含的營養(yǎng)元素有關(guān)。

圖4為小球藻在以酵母提取物為有機質(zhì)的培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)2 d和5 d時的照片，從培養(yǎng)液顏色深淺來看，其結(jié)果與A680值(圖3)相符。

圖3 小球藻在以酵母提取物為有機質(zhì)的培養(yǎng)基中的生長趨勢Fig.3 Growth trend of Chlorella zofingensis cultured with yeast extract as organic matter

圖4 小球藻在以酵母提取物為有機質(zhì)的培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)2 d和5 d時的照片F(xiàn)ig.4 Photos of Chlorella zofingensis cultured with yeast extract as organic matter for 2 d and 5 d

2.3 小球藻在以牛肉膏為有機質(zhì)的培養(yǎng)基中的生長趨勢(圖5)

圖5 小球藻在以牛肉膏為有機質(zhì)的培養(yǎng)基中的生長趨勢Fig.5 Growth trend of Chlorella zofingensis cultured with beef extract as organic matter

從圖5可以看出，當牛肉膏用量為1.0～3.0 g時，小球藻經(jīng)過8 d的培養(yǎng)依然能夠保持一定的生長速度，A680值逐漸升高，但小球藻累積量遠不如以蛋白胨為有機質(zhì)時的累積量；當牛肉膏用量為4.0 g時，小球藻在前7 d生長穩(wěn)定，但第8 d開始出現(xiàn)負增長；當牛肉膏用量增至5.0～6.0 g時，則出現(xiàn)了明顯的抑制生長現(xiàn)象。表明，牛肉膏用量越高越不利于小球藻的代謝。

圖6為小球藻在以牛肉膏為有機質(zhì)的培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)2 d和8 d時的照片，從培養(yǎng)液顏色深淺來看，其結(jié)果與A680值(圖5)相符。

圖6 小球藻在以牛肉膏為有機質(zhì)的培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)2 d和8 d時的照片F(xiàn)ig.6 Photos of Chlorella zofingensis cultured with beef extract as organic matter for 2 d and 8 d

2.4 討論

3種常用微生物培養(yǎng)有機質(zhì)對小球藻生長的影響均與有機質(zhì)的化學組成相關(guān)。蛋白胨的分子量在2 000左右，介于和肽之間，是一個復(fù)雜的多肽混合物，是動物性、植物性、微生物性的蛋白質(zhì)經(jīng)酸、堿或蛋白酶分解后形成的，富含有機氮化合物，也含有一些維生素和糖類，能為小球藻提供碳源、氮源、生長因子等營養(yǎng)物質(zhì)。酵母提取物是酵母菌破壁后經(jīng)抽提得到的蛋白質(zhì)、核酸、維生素等經(jīng)生物酶解得到的富含氨基酸、肽、核苷酸、維生素等天然活性成分的物質(zhì)，其中總蛋白50%以上，氨基酸30%以上，核苷酸10%以上。牛肉膏是新鮮牛肉剔除脂肪后經(jīng)消化、過濾、濃縮而得到的膏狀物，是含肌酸、肌酸酐、多肽類、氨基酸類、核苷酸類、有機酸類、礦物質(zhì)類及維生素類的水溶性物質(zhì)。

在微生物培養(yǎng)中，蛋白胨主要提供氮源和維生素，相比牛肉膏，蛋白胨的來源廣泛，可以為小球藻提供更多種類和數(shù)量的有機氮源(氨基酸和肽類)，完全可以滿足小球藻快速生長的需要。牛肉膏提供碳源、能源、磷酸鹽和維生素，其主要作用是補充蛋白胨以及其它氮源的不足，用量一般為0.3%～0.5%；牛肉膏成分復(fù)雜，氮源是比較單一的動物源性的，其它營養(yǎng)成分雖然能促進大部分微生物生長，但并不適合小球藻的生長，甚至和小球藻代謝物發(fā)生作用，從而起到抑制作用。與蛋白胨和牛肉膏相比，酵母提取物的氮源(可能主要是氨基酸)就更單一了，雖然其氨基酸和總蛋白含量很高，但是并不能滿足小球藻生長的需要，可能與氨基酸的種類和含量有關(guān)。

3 結(jié)論

小球藻的快速生長需要多種氮源，在額外提供無機離子的情況下，蛋白胨對小球藻生長的促進作用最大，其次是牛肉膏，酵母提取物幾乎不能促進小球藻生長。在蛋白胨質(zhì)量濃度為1.00%時，小球藻的生物累積量達到最高；考慮到經(jīng)濟成本，蛋白胨的質(zhì)量濃度以0.60%為宜。