補腎活血湯改善膝骨關節炎大鼠行為學的實驗研究?

湯小康 楊 華 劉慧英 周長征 盧 敏 唐成劍

（湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007）

骨性關節炎（OA）是一種以關節軟骨退變和丟失為主要病理特征的疾病，是中老年人群中的常見病、多發病［1］。中醫理論認為，OA屬“骨痹”范疇，多因機體“肝腎虧虛，風寒濕邪雜至”，致使人體“氣滯血瘀、經絡痹阻”，為“本虛標實、虛實夾雜”之證［2］。補腎活血湯方藥出自《傷科補要》，長于補氣血、強筋骨，其在OA的治療上有著較普遍的運用［3］。本實驗用補腎活血湯對膝骨性關節炎（KOA）大鼠進行治療干預，并收集分析相關行為學數據，為評估補腎活血湯治療KOA療效提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級6周齡SD雄性大鼠18只，體質量（150±20）g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK（湘）2016-0002。實驗前在湖南中醫藥大學第一附屬醫院實驗中心適應性飼養7 d，每籠3只，空氣相對濕度維持在30%～40%，室溫維持在21～23℃，常規標準顆粒飼料及飲用水飼養。觀察7 d，所有動物無疾病及異常后開始實驗。

1.2 實驗藥物

補腎活血湯：熟地黃、破故紙、菟絲子各15 g，杜仲、枸杞子、歸尾、山茱萸肉、肉蓯蓉、沒藥、獨活各9 g，紅花6 g。水煎，每劑200 mL，生藥含量約為0.57 g/mL，由湖南中醫藥大學第一附屬醫院中藥制劑室提供。

1.3 分組與造模

將SD大鼠隨機分為補腎活血湯組、模型組及空白組，每組6只，每只大鼠常規稱體質量并記錄。補腎活血湯組和模型組大鼠常規碘伏與酒精交替消毒腹部和雙膝關節，無菌條件下10%水合氯醛腹腔給藥麻醉，雙膝關節腔注射4%的木瓜蛋白酶0.2 mL，隔日注射1次，連續注射2周。空白組大鼠僅常規碘伏與酒精交替消毒腹部，無菌條件下水合氯醛腹腔給藥麻醉，隔日注射1次，連續注射2周。補腎活血湯組、模型組及空白組大鼠均置于相同飼養環境的標準飼養籠中飼養。

1.4 給藥方法

造模成功后，按人-鼠換算出服藥量為10.31 mg/（kg·d），補腎活血湯組灌胃補腎活血湯，每天2次。模型組和空白組灌胃蒸餾水。連續給藥4周。

1.5 觀察指標

1.5.1 一般情況 連續2周造模給藥結束后，觀察各組大鼠的精神狀態、體質量、膝關節活動度等。

1.5.2 小動物活體雙膝關節活體成像 水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，運用X線片收集各組大鼠雙膝關節影像學圖像，觀察雙膝關節面間隙狹窄、關節面磨損及變形、骨贅生成等情況。

1.5.3 自主活動次數測定 采用大鼠自主活動程序測定儀觀察各組大鼠的自發活動次數。設定測定程序后，將大鼠置入測定箱中，適應3 min后，計算機記錄每只大鼠3 min和5 min內活動次數以評估其活動度。

1.5.4 曠場實驗 給藥結束后，于上午8∶00～12∶00時間段內進行實驗，每只大鼠測定1次，每次10 min。握住SD大鼠尾部1/3處，將其輕輕置入曠場箱中心區域內，開啟計時、錄像，記錄各組SD大鼠的平均速度和運動總長度以評估其活動度。

1.5.5 水迷宮實驗 在同一水迷宮實驗室內，連續訓練4 d，每天訓練1次，若大鼠2 min內未找到高出水面2 cm站臺，則將其抓放至站臺上停留20 s。連續訓練4 d后進行正式測試，記錄各組大鼠找到平臺時間和活動距離以評估其活動度。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況比較

見表1。適應性喂養7 d，造模前補腎活血湯組、模型組和空白組大鼠精神狀態一致，無明顯萎靡、反應遲鈍，雙膝關節無明顯腫脹、活動不利，各組體質量比較差異無統計學意義（P＞0.05）。造模后2周，補腎活血湯組、模型組大鼠較空白組精神萎靡、反應遲鈍，雙膝關節可見腫脹、活動不利；各組體質量比較，組間差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠體質量比較（g，±s）

表1 各組大鼠體質量比較（g，±s）

與空白組造模后比較，?P＜0.05

補腎活血湯組模型組空白組6 6 6 194.00±8.60 195.33±10.23 194.50±8.47 206.83±8.37*202.50±13.37*245.33±7.63

2.2 各組大鼠造模后雙膝關節活體成像比較

造模2周后，各組大鼠雙膝關節影像學圖像顯示：補腎活血湯組和模型組大鼠雙膝關節面間隙狹窄、關節面磨損、變形及骨贅生成較空白組大鼠雙膝明顯。見圖1～圖3。

2.3 各組大鼠自主活動次數比較

見表2。補腎活血湯組、空白組大鼠3 min、5 min內自主活動次數均多于模型組大鼠（P＜0.05）。

2.4 各組大鼠曠場實驗結果比較

見表3。補腎活血湯組、空白組大鼠10 min活動總距離大于模型組大鼠（P＜0.05）。補腎活血湯組、空白組大鼠10 min活動平均速度大于模型組大鼠（P＜0.05）。

圖1 補腎活血湯組雙膝關節X線片

圖2 模型組雙膝關節X線片

圖3 空白組雙膝關節X線片

表2 各組大鼠自主活動次數比較（次，±s）

表2 各組大鼠自主活動次數比較（次，±s）

與模型組比較，△P＜0.05。下同

組別補腎活血湯組模型組空白組n 6 6 6 3 min內65.50±10.56△41.17±6.11 67.67±4.97△5 min內109.00±8.25△62.50±9.42 118.33±5.72△

表3 各組大鼠曠場實驗結果比較（±s）

表3 各組大鼠曠場實驗結果比較（±s）

組別補腎活血湯組模型組空白組n 6 6 6活動總距離（cm）13 396.50±699.32△10 572.67±683.68 16 436.83±716.62△平均速度（cm/s）22.32±1.76△17.62±1.14 27.39±1.19△

2.5 各組大鼠水迷宮實驗結果比較

見表4。補腎活血湯組、空白組大鼠找到平臺時間和活動距離均短于模型組大鼠（P＜0.05）。

表4 各組大鼠水迷宮實驗結果比較（±s）

表4 各組大鼠水迷宮實驗結果比較（±s）

組別補腎活血湯組模型組空白組n 6 6 6找到平臺時間（s）30.17±6.27△46.83±5.98 19.00±2.37△活動距離（cm）1 330.17±128.99△1 741.83±116.95 1 076.33±106.99△

3 討論

OA發病往往導致患者生活質量不同程度的下降，膝關節是OA發病的常見部位［4］。隨著我國人口老齡化程度逐漸上升，KOA已嚴重影響人民的健康［5］。因KOA發病機制復雜，理想的KOA動物模型是研究其發病機制、危險因素及治療方法等的重要手段。實驗動物關節腔給藥誘發KOA方法，具有操作簡單、創傷小、成功率高及更接近人KOA病理過程等特點，可用于觀察KOA早期病理改變及研究藥物對骨關節病變的影響［6-7］。本研究采用4%的木瓜蛋白酶大鼠雙膝關節腔注射，隔日注射1次，連續注射2周。造模后較空白組大鼠精神萎靡、反應遲鈍，雙膝關節可見腫脹、活動不利，體質量顯著低于空白組大鼠，X線片影像學顯示造模大鼠雙膝關節面間隙狹窄、關節面磨損變形及骨贅生成較空白組大鼠明顯。結果說明木瓜蛋白酶膝關節腔注射法能為KOA發病機理及干預措施研究提供良好動物模型［8-9］。

補腎活血湯中君藥為熟地黃和山茱萸肉，具有補益肝腎、氣血的功效；臣藥為破故紙、菟絲子、杜仲、枸杞子和肉蓯蓉，有強筋壯骨的功效；歸尾、沒藥、紅花為佐藥，可起到活血通絡的功效；引藥為獨活［10］。諸藥配伍，共奏補腎活血之效，使肝腎精氣充足，氣通血暢，以達行氣、活血、化瘀之功，腎虛血瘀從源頭解決，諸證得除［11］，在退行性OA的治療中取得了不錯的療效［12-13］。現有研究表明，補腎活血湯具有抑滑膜細胞產生白細胞介素-1β和基質金屬蛋白酶-1的功效［14］，補腎活血湯含藥血清能有效促進體外培養的大鼠骨髓間充質干細胞向軟骨細胞分化［15-16］。自主活動次數、曠場實驗和水迷宮實驗是評估大鼠行為學的重要實驗方法，KOA患者往往表現出主動性活動減少、生活被動等癥狀。在本實驗中與模型組大鼠自主活動次數減少、曠場實驗10 min活動總距離和平均速度降低及水迷宮實驗找到平臺時間和活動距離延長等行為學表現相似，補腎活血湯組大鼠各項行為學指標均優于模型組，說明補腎活血湯具有改善膝骨關節炎大鼠行為學指標，治療KOA的功效。