5種不同果色苦瓜果實單萜成分分析

李家明，林志強，黃則棟，陳露，許茹，鐘鳳林，*

（1.福建農林大學園藝學院，福建福州350002；2.福建省種子管理總站，福建福州350000；3.福建田美種業(yè)科技股份有限公司，福建福州350000）

苦瓜（Momordica charantia L.）是葫蘆科苦瓜屬一年生草本植物，主要以食用嫩瓜為主，口感清爽帶苦味，老熟苦瓜清香而味甜，是一種重要的藥食兼用園藝作物。苦瓜果實中含有豐富的營養(yǎng)物質，主要包括維生素、礦物質元素、氨基酸、類黃酮以及皂苷等生物活性物質[1-3]，具有清熱去火、明目利尿、降血糖、抗癌等藥用功效[4-5]。我國苦瓜品種繁多，通常依據(jù)傳統(tǒng)植物學性狀來進行分類，如苦瓜果實的形狀、果皮的顏色、果實表面瘤狀突起等，按果實顏色可分為：白色、白綠色、黃綠色、淺綠色、綠色、深綠色、墨綠色[6]。相關研究表明，不同果色的果實在口感、營養(yǎng)物質含量上存在差異，果實顏色與果實的品質和風味存在一定的相關性[7-9]。隨著消費者對苦瓜需求的不斷增加，苦瓜果實除了鮮食之外，目前已經開發(fā)出多種苦瓜的加工產品，如苦瓜茶[10]、苦瓜發(fā)酵酒[11]、苦瓜果脯[12]、苦瓜飲料[13]等，探究不同果色苦瓜果實中揮發(fā)性物質的差異，有助于苦瓜加工產品的研發(fā)，拓寬苦瓜消費市場。

單萜類化合物具有揮發(fā)性，是一類重要的揮發(fā)性物質，其感官閾值低，具有濃郁的香味，對果實的香氣起著重要的貢獻作用。目前，在葡萄[14]、柑橘[15]、番茄[16]、甜椒[17]等果實中均有相關研究。苦瓜果實具有獨特的香氣，苦瓜特有的揮發(fā)性物質對苦瓜果實風味品質評價及苦瓜果實副產品加工方面有著重要作用。楊敏[18]的研究結果表明甘肅主產的苦瓜果實主要揮發(fā)性成分為醛類和醇類，不同的揮發(fā)性物質對苦瓜果實香氣貢獻不同。關于苦瓜果實的揮發(fā)性物質成分尚有待進一步研究，本試驗選取不同果實顏色的苦瓜果實，采用頂空固相微萃取（head space solid-phase micro-extractions，HE-SPME）結合氣相色譜-質譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術，探究不同果色苦瓜果實之間單萜類物質成分組成及其含量的差異，并進行主成分分析和聚類分析，從而為苦瓜果實揮發(fā)性物質的研究利用、風味品質的評價以及苦瓜果實的深加工提供一定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試材及儀器

試驗材料于2018 年10 月17 日采摘于福建田美種業(yè)科技股份有限公司白沙育種基地，均選取授粉后15 d 的苦瓜果實，白色苦瓜（K1）、白綠色苦瓜（K2）、黃綠色苦瓜（K3）、淺綠色苦瓜（K4）、綠色苦瓜（K5）果實各采摘3 份作為重復。

SPME 手動進樣器、DVB/CAR/PDMS 萃取頭（50/30 μm）：美國 Supelco 公司產品；Clarus SQ8T 型氣相色譜-質譜聯(lián)用儀：美國Perkin Elmer 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 HS-SPME 取樣

樣品制備、頂空固相微萃取方法和氣相色譜質譜條件在楊敏[18]的方法上有所改動。取不同果色苦瓜果肉中段部分進行勻漿，分別稱取5 g 勻漿置于20 mL樣品瓶中，加入1 g 氯化鈉分析純，密封后置于70 ℃恒溫磁力攪拌器上平衡10 min，樣品3 次重復。把固相微萃取頭置于氣相色譜進樣口于250 ℃條件下老化2 h 后，插入頂空樣品瓶 1/3 處，70 ℃下吸附 30 min。

1.2.2 GC-MS 分析

將固相微萃取頭從樣品瓶中抽出，插入氣相色譜-質譜聯(lián)用儀進樣口處，于250 ℃下解析7 min。

色譜條件：檢測器溫度：250 ℃；進樣器溫度：240 ℃；載氣：He2（純度99.999%）；柱流量：1 mL/min；分流比：15 ∶1；進樣方式：無分流進樣；升溫程序：初始溫度 65 ℃，以 3 ℃/min 的速率升溫至 155 ℃，保持 0 min，以 10 ℃/min 的速率升至 230 ℃，保持 0 min。

質譜條件：接口溫度：240 ℃，離子源溫度：200 ℃，離子方式：EI；電子能量：70 ev；掃描質量范圍：30 u～550 u。

1.2.3 定性及定量分析

通過計算機譜庫（NIST 2011）檢索及結合保留指數(shù)對其進行定性分析。果實中揮發(fā)性物質的定量采用峰面積歸一化法計算出各成分的相對含量。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理及分析

用Excel 2016 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；運用SPSS 21.0 進行顯著性分析、主成分分析和聚類分析。

2 結果與分析

2.1 不同果色苦瓜果實中單萜類物質數(shù)目比較

不同果色苦瓜果實單萜類物質組成比較結果見圖1。

圖1 不同果色苦瓜果實單萜類物質組成比較Fig.1 Comparison of the composition of monoterpenoids in five different fruit color bitter gourd fruits

由圖1 可知，在綠色苦瓜（K5）果實中檢測到單萜類物質成分最多，包括8 種單萜醇、5 種單萜醛、2 種單萜酮、3 種單萜烯、1 種單萜炔，共計19 種單萜類物質。白色苦瓜（K1）果實中檢測到的單萜成分最少，包括8種單萜醇、2 種單萜醛、2 種單萜酮、1 中單萜烯，共計13 種單萜類物質。白綠色苦瓜（K2）、黃綠色苦瓜（K3）和淺綠色苦瓜（K4）果實中分別檢測到 18、16、15 種單萜類物質。在5 種不同果色苦瓜果實中，白綠色苦瓜（K2）果實中單萜醇的物質種類最多，淺綠色苦瓜（K4）最少；綠色苦瓜（K5）果實中單萜醛種類最多，白色苦瓜（K1）最少。單萜炔類物質僅在白綠色苦瓜（K2）、黃綠色苦瓜（K3）和綠色苦瓜（K5）果實中有檢測出，淺綠色苦瓜（K4）果實中單獨檢測到1 種單萜酯類物質，白色苦瓜（K1）中未檢測到單萜酯和單萜炔類物質。

2.2 不同果色苦瓜果實中單萜類物質成分及含量的比較分析

通過對5 種不同果色苦瓜果實揮發(fā)性物質成分進行檢測鑒定及定量分析，共檢測出29 種單萜類物質，具體結果見表1。

包括11 種單萜醇：順式-檜萜醇、桃金娘烯醇、紫蘇醇、順式-馬鞭草烯醇、4-（1-甲基乙基）-1，4-環(huán)己二烯-1-甲醇、2-（4-亞甲基環(huán)己基）丙-2-烯-1-醇、L-紫蘇醇、順式-2，8-薄荷二烯-1-醇、芳樟醇、橙花醇、香葉醇；9 種單萜醛：異環(huán)檸檬醛、反，反-2，4-癸二烯醛、反式-4，5-二環(huán)氧（E）-2-癸烯醛、β-環(huán)檸檬醛、順式-4，5-二環(huán)氧（E）-2-癸烯醛、（2E）-（3，3-二甲基亞）乙醛、1α，2α，5α-2-甲基-5-（1-甲基乙烯基）環(huán)戊烷甲醛、龍腦烯醛、香葉醛；4 種單萜烯：2，5，5-三甲基-庚 1，3ξ，6-三烯、4-甲基-1-（丙-1-烯-2-基）環(huán)己烯、α-氧化蒎烯、1，1-五亞甲基-1，2-戊二烯；3 種單萜酮：側柏酮、α-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮；1 種單萜酯：巴豆酸己烯酯。此外，還有1 種單萜炔類物質：2-甲基-1-壬烯-3-炔。5 種不同果色苦瓜果實共同檢測出的單萜類物質成分有7 種，包括：順式-檜萜醇、桃金娘烯醇、順式-馬鞭草烯醇、橙花醇、香葉醇、α-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮。

表1 5 種不同果色苦瓜單萜類物質成分及相對含量Table 1 Monoterpenoids and their relative contents in five different fruit colors of bitter gourd

續(xù)表1 5 種不同果色苦瓜單萜類物質成分及相對含量Continue table 1 Monoterpenoids and their relative contents in five different fruit colors of bitter gourd

不同果色苦瓜果實中單萜類物質總含量之間存在顯著差異：白綠色苦瓜（K2）＞黃綠色苦瓜（K3）＞白色苦瓜（K1）＞綠色苦瓜（K5）＞淺綠色苦瓜（K4）。對共有的7 種單萜類物質成分含量比較發(fā)現(xiàn)：白綠色苦瓜（K2）的共有物質成分含量最高，占總含量的70.702%，綠色苦瓜（K5）最低，占總含量的50.059%。其中，共有揮發(fā)性物質成分桃金娘烯醇的含量為最高，含量均超過揮發(fā)物總含量的40%，白綠色苦瓜（K2）果實的桃金娘烯醇含量高達64.152%，而綠色苦瓜（K5）果實中的桃金娘烯醇含量相對較低，占揮發(fā)物總含量的41.332%，可推測桃金娘烯醇為5 種不同果色苦瓜果實中共有的香氣物質。白綠色苦瓜（K2）果實中順式-檜萜醇、桃金娘烯醇、順式-馬鞭草烯醇的釋放量顯著高于其他4種顏色的苦瓜；綠色苦瓜（K5）果實中橙花醇、香葉醇、α-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮的釋放量顯著高于其他4 種顏色苦瓜。對差異物質進行比較可知：白綠色苦瓜（K2）果實中檢出獨有的揮發(fā)性單萜類物質成分為順式-2，8-薄荷二烯-1-醇；黃綠色苦瓜（K3）果實中檢出獨有的物質為（2E）-（3，3-二甲基亞）乙醛；淺綠色苦瓜（K4）獨有的單物質為異環(huán)檸檬醛、巴豆酸己烯酯；綠色苦瓜（K5）獨有的物質為β-環(huán)檸檬醛、香葉醛。

2.3 不同果色苦瓜果實單萜類物質的主成分分析

以單萜類物質成分的相對含量數(shù)據(jù)為參數(shù)，對除桃金娘烯醇外的28 種單萜類揮發(fā)性物質進行主成分分析，具體結果見圖2。

圖2 不同果色苦瓜單萜類物質得分散點圖Fig.2 The dispersive point diagram of monoterpenoids in different fruit colors of bitter gourd

根據(jù)特征值大于1 原則，共提取2 個主成分，這2個主成分的累積方差貢獻率為83.073%，能夠反映原始數(shù)據(jù)的絕大部分信息，其中主成分1（PC1）和主成分2（PC2）分別解釋了57.569%和25.504%的變量信息。在PC1 中，C1 號順式—檜萜醇、C12 號β-環(huán)檸檬醛、C17 號香葉醛、C18 號側柏酮、C27 號香葉醇、C28 號α-紫羅蘭酮的載荷最高，對第一主成分貢獻率最大。在 PC2 中，C7 號 L—紫蘇醇、C11 號反式-4，5-二環(huán)氧（E）-2-癸烯醛、C13 號順式-4，5-二環(huán)氧（E）-2-癸烯醛、C15 號 1α，2α，5α-2-甲基-5-（1-甲基乙烯基）環(huán)戊烷甲醛、C29 號β-紫羅蘭酮對第二主成分貢獻率較大。

2.4 不同果色苦瓜果實聚類分析

對5 種不同果色苦瓜果實的單萜類物質成分采用平方歐式距離類平均法進行聚類分析，結果如圖3所示。

圖3 不同果色苦瓜果實單萜類物質成分的聚類圖Fig.3 Cluster analysis tree diagram of different fruit bitter gourd

在距離為10 時將5 種不同果色苦瓜分為2 組，其中白色苦瓜（K1）、黃綠色苦瓜（K3）和白綠色苦瓜（K2）聚為第Ⅰ組，淺綠色苦瓜（K4）和綠色苦瓜（K5）聚類為第Ⅱ組。聚類分析結果表明在白色苦瓜（K1）、黃綠色苦瓜（K3）和白綠色苦瓜（K2）果實中檢測到的單萜類物質成分和含量上具有較高的相似性；淺綠色苦瓜（K4）和綠色苦瓜（K5）果實中的單萜類物質在成分組成和含量上相似性較高。

3 結果與討論

目前，關于苦瓜揮發(fā)性物質的研究主要集中在干燥方式對苦瓜茶的品質及揮發(fā)性物質的影響[19]，除此之外，在苦瓜種子[20-21]、葉片[22]揮發(fā)油等方面也有相關研究。本研究針對不同果色苦瓜果實揮發(fā)性物質中的單萜類物質成分進行鑒定分析，發(fā)現(xiàn)單萜類物質在苦瓜果實揮發(fā)性物中占重要地位，單萜類物質成分含量均超過苦瓜揮發(fā)性物質總含量的55%，說明苦瓜果實中的主要揮發(fā)性物質為單萜類物質，包括單萜醇、單萜醛、單萜酮、單萜烯烴類、單萜炔烴類及單萜酯。楊敏[18]和張小鳳[23]的研究結果表明，苦瓜果實揮發(fā)性物質主要是醇類和醛類物質，這兩類物質為苦瓜果實香氣具有重要貢獻作用，本試驗結果與其相符。但在苦瓜具體物質成分和含量上有很大差異，可能是因為苦瓜品種、成熟度、種植地區(qū)和栽培模式等存在差異，造成揮發(fā)性物質成分和含量有較大差異。

單萜類物質對果實的香氣以及風味品質有著重要的影響，其感官閾值低，香味濃郁，從不同程度上對果實風味起著至關重要的作用，在葡萄[24]、玫瑰[25]、茶葉[26]等植物中是重要的香氣物質。除此之外，單萜類物質在食品[26]、農業(yè)[27]、醫(yī)藥[28]等方面有很廣泛的應用。本試驗在5 種果色苦瓜果實中檢測到的單萜成分達29 種，其中單萜醇類物質桃金娘烯醇的含量最高，含量均超過揮發(fā)物總含量的40%，白綠色苦瓜（K2）果實中桃金娘烯醇含量最高，占揮發(fā)性物質總含量的64.152%。桃金娘烯醇具有檀木香和薄荷清香，用途廣泛，可以用做香料、香精、合劑和修飾劑等[26]?？喙瞎麑崜]發(fā)性物質中桃金娘烯醇的相對含量最高，可以推測桃金娘烯醇為苦瓜果實的特征性香氣物質，可為苦瓜果實提供濃郁的清香。5 種不同果色苦瓜共有單萜類物質僅7 種，順式-檜萜醇、桃金娘烯醇、順式-馬鞭草烯醇、橙花醇、香葉醇、α-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮，共有成分含量均超過揮發(fā)物總含量的50%，構成5 種不同果色苦瓜的主體風味。不同果色苦瓜之間單萜類物質成分差異較大，能夠提供不同果色苦瓜自身的特有香味，白綠色苦瓜（K2）特有的物質為順式-2，8-薄荷二烯-1-醇；黃綠色苦瓜（K3）特有的物質為（2E）-（3，3-二甲基亞）；淺綠色苦瓜（K4）特有的物質為異環(huán)檸檬醛和巴豆酸己烯酯；綠色苦瓜（K5）特有的物質為β-環(huán)檸檬醛和香葉醛。通過對不同果色苦瓜果實單萜類物質的主成分分析，除桃金娘烯醇外對苦瓜果實香氣有重要貢獻的物質為順式—檜萜醇、β-環(huán)檸檬醛、香葉醛、側柏酮、C 香葉醇、α-紫羅蘭酮、L—紫蘇醇、反式-4，5-二環(huán)氧（E）-2-癸烯醛、順式-4，5-二環(huán)氧（E）-2-癸烯醛、1α，2α，5α-2-甲基-5-（1-甲基乙烯基）環(huán)戊烷甲醛、β-紫羅蘭酮，這些物質雖然相對含量不高，但由于其香氣閾值低，也能夠從不同程度上對苦瓜果實的香氣做出貢獻。

顏色相近的苦瓜果實之間存在共有的單萜物質成分：白色苦瓜（K1）和白綠色苦瓜（K2）果實中檢測出的共有單萜類物質是龍腦烯醛和芳樟醇；白綠色苦瓜（K2）和黃綠色苦瓜（K3）共同檢測出含量相對較高的側柏酮；黃綠色苦瓜（K3）和淺綠色苦瓜（K4）果實中共存的物質為紫蘇醇，淺綠色苦瓜（K4）和綠色苦瓜（K5）果實中共有物質為 2，5，5-三甲基-庚 1，3ξ，6-三烯，表明果實顏色相近的苦瓜在揮發(fā)性單萜類物質成分組成上具有共性。聚類分析將5 種不同果色苦瓜分為兩類，第一類苦瓜果實顏色為白色、白綠色、黃綠色，顏色整體偏淺，單萜類物質相對含量較高，超過63%，這3 種果色苦瓜果實單萜類成分及含量最為相似，可分為一類。第二類苦瓜果實顏色綠色偏深，但單萜類物質總含量相對較低，占揮發(fā)物總含量的55%左右，這兩種果色苦瓜果實在單萜成分的組成及含量上具有一定的相似性，可分為第二類。觀察苦瓜果實顏色變化與揮發(fā)物總含量之間的關系可發(fā)現(xiàn)：苦瓜果實的顏色深淺與單萜類物質的組成和相對含量具有一定的相關性，可在后續(xù)研究中進一步證明。