柱前衍生-高效液相色譜法測(cè)定野芭蕉不同部位的18種氨基酸含量

黃元河，潘喬丹，黎惠琴，蘭培，黃健

（1.右江民族醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西百色533000；2.右江民族醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣西百色533000）

野芭蕉（Musa balbisiana Colla）為芭蕉科芭蕉屬多年生草本植物，產(chǎn)云南西部、廣西、廣東，生于溝谷坡地的濕潤(rùn)常綠林中[1]。右江流域壯族人民在夏季長(zhǎng)期將野生芭蕉芯和芭蕉花作為蔬菜食用[2]。野芭蕉具有多種功效，其中野芭蕉芯具有化痰軟堅(jiān)、平肝、和瘀、通經(jīng)的功效，適合于胸膈飽脹、脘腹痞疼、吞酸反胃、嘔吐痰涎、頭目昏眩、心痛怔忡、婦女經(jīng)行不暢的人群[3]，其提取物有明顯的降血糖、調(diào)節(jié)血脂的作用[4]；野芭蕉果能改善高血壓患者氧化應(yīng)激功能紊亂[5]，治療自發(fā)性高血壓[6]，對(duì)治療高血壓伴穩(wěn)定勞力型心絞痛經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）術(shù)后患者炎癥具有較強(qiáng)的輔助作用[7]；野芭蕉根提取物可以用于治療Ⅱ型糖尿病[8]；野芭蕉芯提取液能夠抑制草酸鈣結(jié)晶的形成[9]。氨基酸是生物功能大分子蛋白質(zhì)的基本組成單位，是生物代謝過程中的重要物質(zhì)[10]，其含量是評(píng)價(jià)食品和中藥材品質(zhì)的一項(xiàng)重要指標(biāo)[11]。目前用于氨基酸檢測(cè)的方法中，高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法最為廣泛，具有準(zhǔn)確快速特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于食品藥品的檢測(cè)[12-13]。因此本試驗(yàn)采用柱前衍生高效液相色譜法，研究野芭蕉芯、野芭蕉花和野芭蕉苞片中18 種氨基酸的組成和含量，評(píng)價(jià)其藥食兩用的品質(zhì)，為野芭蕉芯和野芭蕉花在食品、保健食品，以及藥品的深入開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

野芭蕉芯和野芭蕉花購：百色市大菜市，經(jīng)過右江民族醫(yī)學(xué)院生物學(xué)教研室黃元河副教授鑒定，野芭蕉花（Musa balbisiana Colla）為花序（包括苞片和花），野芭蕉芯為野芭蕉地上假莖的髓部，即未發(fā)育成熟葉片的葉柄。

1.2 試劑

18 種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品 [天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、絲氨酸（Ser）、甘氨酸（Gly）、組氨酸（His）、精氨酸（Arg）、蘇氨酸（Thr）、丙氨酸（Ala）、脯氨酸（Pro）、半光氨酸（Cys）、酪氨酸（Tyr）、纈氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）、賴氨酸（Lys）]：上海源葉生物科技有限公司；異硫氰酸苯酯、正己烷、乙腈、甲醇（色譜純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；冰乙酸、無水乙酸鈉、濃鹽酸、三乙胺（分析純）：南寧西隴化工有限公司；試驗(yàn)用水為超純水。

1.3 儀器

LC-20A 高效液相色譜儀：島津企業(yè)管理中國有限公司；KQ2200DE 型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀有限公司；SHB-III 循環(huán)水式多用真空泵：鞏義市予華儀器有限公司；HHS-21-4 電熱式恒溫水浴鍋：江蘇金壇宏凱儀器廠；FA1104 型電子天平：上海良平儀器儀表有限公司；安亭TGL-15B 高速臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；XW-80A 旋渦混合器：上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠；RE-3000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；Mill-Q 超純水機(jī)：美國密理博公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 色譜分析條件

Shim-pack VP-ODS 色譜柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm），柱溫 40 ℃，流速 1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng) 254 nm，單次進(jìn)樣品20 μL。流動(dòng)相A 為0.1%醋酸鈉緩沖溶液（pH 6.5）-乙腈（93 ∶7），流動(dòng)相 B 為乙腈-水（4 ∶1），梯度洗脫：0 min，0%B；11 min，7.0%B；13.9 min，12.0%B；14 min，15.0%B；29 min，34.0%B；32 min，50.0%B；37min，100%B；50 min，0%B。

1.4.2 衍生化溶液的制備

衍生試劑A（1 mol/L 三乙胺乙腈）：精密量取1.4 mL三乙胺至10 mL 量瓶中，用乙腈定容，混勻，4 ℃保存；衍生試劑B（0.1 mol/L 異硫氰酸苯酯乙腈溶液）：精密量取0.12 mL 異硫氰酸苯酯10 mL 容量瓶中，用乙腈定容，混勻，4 ℃保存。

1.4.3 混合對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

分別稱取 Asp 43.6 mg、Glu 43.6 mg、Ser 24.3 mg、Gly 24.3 mg、His 43.9 mg、Arg 12.1 mg、Thr 24.4 mg、Ala24.0 mg、Pro 24.3 mg、Tyr 22.0 mg、Val22.0 mg、Met 22.4 mg、Ile 24.4 mg、Leu 22.5 mg、Phe 23.8 mg、Lys 24.0 mg、Cys 22.0 mg、Trp 22.5 mg，加入 0.1 mol/L 鹽酸溶液，置于100 mL 容量瓶定容，制備混合對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品溶液，4 ℃保存。

1.4.4 供試品水解氨基酸溶液的制備

精密稱取樣品粉末1.0 g，加入6 mol/L 鹽酸水溶液10 mL、1%的苯酚1mL，抽真空充氮?dú)猓貜?fù)3 次，于110 ℃烘箱中水解24 h，過濾得水解液，水解液水浴揮干，加入2 mL 的純凈水超聲溶解，并用3 mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液pH 值近中性，用超純水定容至50 mL，即得供試品溶液。

1.4.5 衍生反應(yīng)

分別精密移取混合對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品溶液、供試品水解氨基酸溶液各400 μL 置于1.5 mL 離心管中，加入1 mol/L的三乙胺乙腈溶液200 μL，0.1 mol/L 異硫氰酸苯酯乙腈溶液 200 μL，混勻，25 ℃避光放置 1 h，加入正己烷800 μL，渦旋振蕩 5 min，放置 10 min，12 000 r/min 離心5 min，取下層溶液，制得衍生化溶液。0.22 μm 濾膜濾過，超聲 5 min，進(jìn)樣 20 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系考察

精密吸取“1.4.3”混合對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.5、1.25、2.0、2.5、3.75、5.0 mL 分別置于 5 mL 量瓶中，加 0.1 mol/L鹽酸溶液定容至刻度，精密吸取上述系列溶液各400 μL衍生化處理。取20 μL 進(jìn)行色譜分析。分別以各種氨基酸質(zhì)量濃度（μg/mL）為x 坐標(biāo)，相應(yīng)的氨基酸衍峰面積數(shù)值為y 坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程?；貧w方程見表1，色譜圖見圖1。

表1 18 種氨基酸的的線性關(guān)系Table 1 The linearity relationships of 18 amino acids

圖1 氨基酸對(duì)照品和空白組HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of amino acid reference substances and blank control

以18 種氨基酸特征色譜峰的信噪比（S/N）≥3 時(shí)為該方法的檢出限，S/N≥10 時(shí)為該方法的定量限。由表1 可見，在線性范圍內(nèi)，各種氨基酸的進(jìn)樣量對(duì)數(shù)值與峰面積的對(duì)數(shù)值R2均大于0.999 0，線性關(guān)系良好。由圖1 可見，18 種氨基酸衍生后峰型良好，分離清晰。

2.2 精密度試驗(yàn)

取混合對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品溶液，衍生后連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定峰面積。結(jié)果顯示18 種氨基酸峰面積的標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）（n=6）在 0.62%～1.64%之間，表明儀器精密度良好。

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別取同一批次的野芭蕉芯、野芭蕉花和野芭蕉苞片各 6 份，水解、衍生、進(jìn)樣，分別于 0、3、6、9、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定峰面積，計(jì)算得18 種氨基酸峰面積的RSD。結(jié)果表明野芭蕉芯、野芭蕉花和野芭蕉苞片18 種氨基酸峰面積的RSD（n=6）在0.62%～2.27%之間，說明測(cè)試樣品在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

分別取同一批次野芭蕉芯、野芭蕉花和野芭蕉苞片各6 份，水解、衍生、進(jìn)樣，測(cè)定氨基酸含量。結(jié)果顯示野芭蕉芯、野芭蕉花和野芭蕉花序苞片18 中水解氨基酸含量RSD（n=6）在0.38%～2.29%之間，說明該方法重復(fù)性好。

2.5 加樣品回收試驗(yàn)

取已測(cè)定含量的野芭蕉芯、野芭蕉花和野芭蕉苞片樣品1 g 共6 份，分別加入混合對(duì)照品溶液5 mL，水解、衍生、進(jìn)樣，測(cè)定氨基酸含量，計(jì)算平行6 次算各氨基酸的回收率。結(jié)果野芭蕉芯中18 種氨基酸的平均回收率（n=6）在95.2%～102.3%之間，RSD 在0.57%～2.57%之間；野芭蕉花18 種氨基酸的平均回收率（n=6） 在 97.2%～101.4% 之間，RSD 在 0.78%～2.18% 之間；野芭蕉苞片18 種氨基酸的平均回收率（n=6）在96.3%～100.2% 之間，RSD 在 0.88%～1.81% 之間。

2.6 樣品測(cè)試

分別取3 批次野芭蕉芯、野芭蕉花和野芭蕉苞片樣品，水解衍生化、測(cè)定3 個(gè)部分水解氨基酸的含量，結(jié)果見表2 和表3，色譜圖見圖2。

根據(jù)氨基酸的用途，氨基酸可以分為人體必需氨基酸、甜味氨基酸、苦味氨基、鮮味氨基酸和藥效氨基酸[10]。從表2 可以看出野芭蕉芯、野芭蕉花和野芭蕉苞片均檢測(cè)出18 種解氨基酸，其中8 種為人體必需氨基酸；野芭蕉芯中鮮味氨基酸Asp 含量最高，野芭蕉花和野芭蕉苞片中鮮味氨基酸Glu 含量最高。從表3 可見，野芭蕉芯、野芭蕉花和野芭蕉苞片檢測(cè)到18 種氨基酸總量依次為 36.46、33.21、42.01 mg/g，必需氨基酸總含量分別為13.69、6.48、17.75 mg/g，分別占總氨基酸的36.55%、19.50%、42.26%，含量較高。野芭蕉3 個(gè)部位中野芭蕉花的鮮味氨基酸含量最高到了17.55 mg/g，6 種甜味氨基酸的含量占氨基酸總含量的比例均大于36%，甜味氨基酸和鮮味氨基酸總含量遠(yuǎn)大于8 種苦味氨基酸含量；14 種藥效氨基酸的總含量分別占總氨基酸含量的74.33%，83.11%和75.24%。由圖2 可見，野芭蕉各部分HPLC 色譜圖中各氨基酸衍生后的峰分離度較好，且峰型清晰，此方法適合野芭蕉各部分的氨基酸成分測(cè)定。

表2 野芭蕉芯、野芭蕉花和野芭蕉苞片18 種氨基酸的含量（）Table 2 The contents of 18 amino acids in the stem，flower and bracts of Musa balbisiana（）

表2 野芭蕉芯、野芭蕉花和野芭蕉苞片18 種氨基酸的含量（）Table 2 The contents of 18 amino acids in the stem，flower and bracts of Musa balbisiana（）

注：*為人體必需氨基酸；▲為甜味氨基酸；△為苦味氨基；※為鮮味氨基酸；★為藥效氨基酸。

峰號(hào)氨基酸水解氨基酸含量/（μg/g）野芭蕉芯 野芭蕉花 野芭蕉苞片1天冬氨酸 Asp※★ 6 604.76±80.42 4 583.26±33.67 770.25±7.67 2谷氨酸 Glu※▲★ 2 372±29.14 12 964.17±123.83 5 389.46±23.63 3絲氨酸 Ser▲★ 2 047.94±22.67 1 271.88±23.38 2 406.32±31.14 4甘氨酸 Gly▲★ 2 269.24±19.01 802.16±25.77 2 276.56±38.97 5組氨酸 His△★ 1 066.27±10.5 993.35±17.14 1 200.46±13.35 6精氨酸 Arg△★ 2 660.93±38.69 1 838.38±27.05 3 325.85±32.29 7蘇氨酸 Thr*▲★ 2 027.65±39.01 964.94±26.55 2 092.71±24.67 8丙氨酸 Ala▲ 2 741.67±22.43 1 002.71±25.24 2 532.87±30.72 9脯氨酸 Pro▲△ 2 240.02±32.31 2 673.88±41.29 2 501.45±37.53 10 酪氨酸 Tyr★ 1 270.03±13.71 453.9±8.88 1 669.65±26.43 11 纈氨酸Val*△ 2 552.85±29.02 1 201.98±26.07 3 182.66±48.25 12 甲硫氨酸Met*△★ 434.71±5.13 122.58±3.23 325.13±5.38 13 半胱氨酸Cys★ 495.85±4.36 146.67±3.70 375.48±5.47 14 異亮氨酸Ile*△★ 2 239.94±10.66 861.14±13.73 2 443.87±38.08 15 亮氨酸 Leu*△★ 3 409.64±32.06 1 295.97±14.59 3 594.13±32.23 16 苯丙氨酸Phe*△ 2 083.19±29.4 728.42±9.41 2 185.32±18.29 17 色氨酸Trp*★ 117.29±1.27 181.36±2.18 1 335.47±13.6 18 賴氨酸Lys*★ 828.1±8.46 1 120.16±15.73 2 593.04±32.78

表3 野芭蕉芯、野芭蕉花和野芭蕉苞片各類氨基酸含量和比例Table 3 The contents and proportions of amino acids in the stem，flowers and bracts of Musa balbisiana

圖2 野芭蕉芯、野芭蕉花和野芭蕉苞片HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of the hydrolysis amino acids in the stem，flower and bracts of Musa balbisiana

3 結(jié)論

本研究采用Shim-pack VP-ODS 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相A 為 0.1 %醋酸鈉緩沖溶液（pH6.5）-乙腈（93 ∶7），流動(dòng)相 B 為乙腈-水（4 ∶1），柱前衍生-HPLC 法檢測(cè)野芭蕉芯、野芭蕉花和野芭蕉苞片中水解氨基酸含量，結(jié)果顯示該方法具有精密高、穩(wěn)定性強(qiáng)、重復(fù)性好等特點(diǎn)。通過該法檢測(cè)顯示野芭蕉芯、野芭蕉花和野芭蕉苞片的18 種氨基酸種類齊全，總含量較高，且高于馬博等[14]測(cè)試的試驗(yàn)結(jié)果，這可能與其采收和產(chǎn)地相關(guān)。野芭蕉3 個(gè)部分中，野芭蕉苞片氨基酸總含量最高，野芭蕉3 個(gè)部分甜味氨基酸和鮮味氨基酸總含量遠(yuǎn)大于苦味氨基酸含量，藥用氨基酸含量比例均大于70%。因此野芭蕉芯、野芭蕉花和野芭蕉苞片可以作為人類植物源蛋白質(zhì)的重要補(bǔ)充，可以作為新資源食品開發(fā)。