響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取側(cè)柏葉總黃酮工藝

王樹寧，宋照軍，黃瀅潔，趙功玲，梁新紅，劉本國

（河南科技學(xué)院食品學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003）

側(cè)柏葉是柏科植物側(cè)柏的干燥嫩枝梢及葉，具有涼血止血，生發(fā)烏發(fā)，祛風(fēng)降濕，化痰止咳，消腫散毒的功效[1-2]。側(cè)柏葉中含有多種活性物質(zhì)，主要是類黃酮、揮發(fā)油以及鞣質(zhì)等，其中黃酮類的含量較為豐富[3-4]，且被認為是主要功能成分之一，其功效已引起許多科研工作者的關(guān)注[5-7]。現(xiàn)代藥理學(xué)證明，黃酮具有抑菌消炎、抗腫瘤、抗氧化、止血以及生發(fā)烏發(fā)等作用[8-12]。

近年來關(guān)于側(cè)柏葉的研究主要集中在黃酮類的檢測及應(yīng)用，研究證實側(cè)柏葉中黃酮的主要成分為蘆丁、槲皮素、楊梅素及穗花杉雙黃酮等[13-15]。目前國內(nèi)廣泛采用溶劑法提取側(cè)柏葉中的活性成分[16-17]，但操作繁瑣、耗時耗能、提取率低。超聲波輔助提取技術(shù)具有高效、穩(wěn)定、節(jié)能等優(yōu)點，與傳統(tǒng)的提取方法相比，提取時間短，提取效率高，深受人們歡迎[18]。本試驗通過超聲波對側(cè)柏葉進行處理，通過單因素試驗考察超聲波時間、超聲波溫度以及超聲波頻率對黃酮得率的影響，采用響應(yīng)面法優(yōu)化最佳提取工藝，為工業(yè)化生產(chǎn)黃酮類化合物提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

側(cè)柏葉：安徽亳州惠民中藥材批發(fā)商行；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%）：北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司；乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉（均為國產(chǎn)分析純）：山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

KQ-100DB 型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；FA224 型電子天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；720 型分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 側(cè)柏葉干粉的制備

清洗、晾干側(cè)柏葉，放置于60 ℃的烘箱中烘干4 h，用粉碎儀粉碎，過60 目篩，備用。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用蘆丁作標(biāo)準(zhǔn)品[19]，采50 %的乙醇配制濃度為0.2 mg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，于 25 mL 的比色管中，各加入5%的亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，再各加10%的硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，加1 mol/L 的氫氧化鈉10 mL，加50%乙醇至刻度，搖勻，放置10 min，于510 nm 下測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算回歸方程。

1.3.3 樣品中黃酮的提取及測定

稱取側(cè)柏葉干粉1 g，加入50%的乙醇溶液20 mL。利用超聲波輔助提取黃酮，過濾提取液，濾渣再加入50%的乙醇20 mL 再提取一次，合并濾液，記錄總體積數(shù)，為樣品溶液。取樣品溶液5 mL，置于25 mL 的比色管中，按1.3.2 中方法操作，測定樣品中黃酮含量，按公式（1）所示計算黃酮得率。

式中：C 為依據(jù)回歸方程計算的樣品中黃酮含量，（mg/mL）；5 為為測定用樣品濾液體積，mL；V 為樣品濾液總體積，mL；M 為為側(cè)柏葉質(zhì)量，g。

1.4 單因素試驗設(shè)計

1.4.1 超聲波時間對黃酮得率的影響

稱取7 份1 g 的側(cè)柏葉干粉，加入50%的乙醇溶液20 mL，在超聲波溫度60 ℃，超聲波頻率50 kHz，分別超聲波處理 10、20、30、40、50、60、70 min，提取黃酮，考察不同超聲波時間對黃酮得率的影響。每個試驗重復(fù)3 次。

1.4.2 超聲波溫度對黃酮得率的影響

稱取7 份1 g 的側(cè)柏葉干粉，加入50%的乙醇溶液20 mL，固定超聲波時間50 min，超聲波頻率50 kHz，分別在 20、30、40、50、60、70、80 ℃超聲波下提取黃酮，考察不同超聲波溫度對黃酮得率的影響。每個試驗重復(fù)3 次。

1.4.3 超聲波頻率對黃酮得率的影響

稱取7 份1 g 的側(cè)柏葉干粉，加入50%的乙醇溶液 20 mL，設(shè)置超聲波頻率 7 個水平：20、30、40、50、60、70、80 kHz，固定超聲波時間 50 min，超聲波溫度60 ℃，考察不同超聲波頻率對黃酮得率的影響。每個試驗重復(fù)3 次。

1.5 響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面試驗，以黃酮得率為響應(yīng)值，確定超聲波法提取側(cè)柏葉黃酮的最佳工藝條件，如表1 所示。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Design factors and level of response surface test

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1 所示。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Rutin standard curve

式中：A 為吸光度；C 為蘆丁的濃度，（μg/mL）。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 超聲波時間對黃酮得率的影響

超聲波時間對黃酮得率的影響見圖2。

圖2 超聲波時間對黃酮得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on the yield of flavonoids

由圖2 可知，隨超聲時間的延長，黃酮得率逐漸上升，在50min 時達到最大值，其值為（25.830±0.065）mg/g，隨著時間繼續(xù)增加，黃酮得率下降，超聲處理時間為70 min 時，黃酮得率下降至（24.220±0.065）mg/g。超聲時間過短，植物細胞破碎不完全，造成提取的黃酮得率低；超聲時間過長，產(chǎn)生的熱效應(yīng)可能造成黃酮的氧化，從而使黃酮得率降低。因此，選擇超聲波時間為50 min 比較合適。

2.2.2 超聲波溫度對黃酮得率的影響

超聲波溫度對黃酮得率的影響見圖3。

圖3 超聲波溫度對黃酮得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on the yield of flavonoids

由圖3 可知，在超聲溫度為20 ℃～60 ℃時，黃酮得率逐漸上升，在60 ℃達到最大值，其值為（26.300±0.024）mg/g，隨著超聲溫度繼續(xù)升高，黃酮得率下降，超聲溫度為80 ℃時，黃酮得率下降至（24.160±0.035）mg/g。可能原因是超聲波溫度過低，分子熱運動慢，不利于黃酮的溶出；溫度過高，黃酮易分解，造成得率降低。因此，選擇超聲波溫度為60 ℃比較合適。

2.2.3 超聲波頻率對黃酮得率的影響

超聲波頻率對黃酮得率的影響見圖4。

圖4 超聲波頻率對黃酮得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic frequency on the yield of flavonoids

由圖4 可知，在超聲頻率為 20 kHz～50 kHz 時，黃酮得率逐漸上升，在50 kHz 時達到最大值，其值為（26.081±0.073）mg/g，隨著超聲頻率繼續(xù)增加，黃酮得率下降，超聲頻率為80 kHz 時，黃酮得率下降至（20.412±0.035）mg/g。因此，選擇超聲波頻率為50 kHz比較合適。

2.3 響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.3.1 分響應(yīng)面析方案與試驗結(jié)果

按照表1 設(shè)計進行響應(yīng)面試驗，分析方案與試驗結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面分析方案與試驗結(jié)果Table 2 Response surface analysis scheme and test results

2.3.2 回歸方程的建立及顯著性分析

根據(jù)響應(yīng)面試驗結(jié)果，采用ANOVA 對表2 中的數(shù)據(jù)進行多元二次回歸，得到黃酮得率（Y）與超聲波時間（A）、超聲波溫度（B）、超聲波頻率（C）之間的二次多項回歸方程為：

Y=-32.033 25+1.810 62A+0.412 48B+0.038 250C+1.450 00×10-3AB-6.375 00×10-3AC+4.625 00×10-3BC-0.016 105A2-5.622 00×10-3B2-2.800 00×10-4C2。回歸模型方差分析見表3。

表3 為回歸方程的方差分析表，由方差分析結(jié)果可知，該回歸方程模型極顯著（P＜0.01），失擬項P 值為0.127 4＞0.05，失擬性差異不顯著。B、AC、A2、B2對側(cè)柏葉黃酮得率的影響極顯著（P＜0.01），A、C、BC 對側(cè)柏葉黃酮得率的影響顯著（P＜0.05），AB、C2對側(cè)柏葉黃酮得率的影響不顯著（P＞0.05），各因素對黃酮得率的影響依次是B（超聲波溫度）＞A（超聲波時間）＞C（超聲波頻率）。相關(guān)系數(shù)R2為0.967，變異系數(shù)為1.180%，表明試驗數(shù)據(jù)較可靠，該模型擬合度較高，可以用于超聲波法提取側(cè)柏葉中總黃酮的理論預(yù)測。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

2.3.3 響應(yīng)面分析

響應(yīng)值與各試驗因素，及各因素交互作用構(gòu)成的等高線和響應(yīng)面見圖5、圖6、圖7，考察超聲波時間、超聲波溫度、超聲波頻率中任意一個因素水平在零時，其他兩個因素的交互作用對黃酮得率的影響。圖5為超聲波頻率為50 kHz 時，超聲波時間和超聲波溫度對黃酮得率的影響。

由圖5 可以看出，在超聲波時間一定時，黃酮得率隨超聲波溫度先增大然后趨于平緩；在超聲波溫度一定時，黃酮得率隨超聲波時間先增大后降低。等高線接近圓形，且響應(yīng)面坡度較小，表明超聲波時間和超聲波溫度的交互作用不顯著，這與回歸方程方差分析的結(jié)果相符。圖6 為超聲波溫度為60 ℃時，超聲波時間和超聲頻率度對黃酮得率的影響。

圖5 超聲波時間和超聲波溫度對黃酮得率的等高線和響應(yīng)面圖Fig.5 Contour and response surface of ultrasonic time and temperature to flavonoid yield

圖6 超聲波時間和超聲波頻率對黃酮得率的等高線和響應(yīng)面圖Fig.6 Contour and response surface of ultrasonic time and frequency to flavonoid yield

由圖6 可以看出，在超聲波時間一定時，黃酮得率隨超聲波頻率先增大后趨于平緩；在超聲波頻率一定時，黃酮得率隨超聲波時間先增大后降低。等高線密集，且接近橢圓形，響應(yīng)面坡度較陡峭，說明超聲波時間和超聲波頻率的交互作用極顯著。圖7 為超聲波時間為50 min 時，超聲波溫度和超聲波頻率對黃酮得率的影響。

圖7 超聲波溫度和超聲波頻率對黃酮得率的等高線和響應(yīng)面圖Fig.7 Contour and response surface of ultrasonic temperature and frequency to flavonoid yield

由圖7 可以看出，在超聲波溫度一定時，黃酮得率隨超聲波頻率先增大后降低；在超聲波頻率一定時，黃酮得率隨超聲波溫度的增大而降低。等高線密集且響應(yīng)面坡度陡峭，說明超聲波溫度和超聲波頻率的交互作用顯著。

2.3.4 最佳工藝條件的確定及驗證試驗

根據(jù)所得到的回歸模型，預(yù)測得到超聲波法輔助提取側(cè)柏葉中黃酮的最佳工藝條件為：超聲波時間50.98 min、超聲波溫度59.38 ℃、超聲波頻率40 kHz，此時側(cè)柏葉總黃酮理論得率可達26.430 mg/g。結(jié)合實際情況將最佳工藝條件修改為：超聲波時間51 min、超聲波60 ℃、超聲波頻率40 kHz，并在此條件下進行3次驗證試驗，結(jié)果側(cè)柏葉總黃酮平均得率（26.350±0.065）mg/g，實際值與理論值26.430 mg/g 的誤差僅為0.08%，證明了該試驗?zāi)Ｐ秃侠恚瑑?yōu)化的提取工藝切實可行，適用于側(cè)柏葉總黃酮的提取。

3 結(jié)論

本試驗采用超聲波法輔助提取側(cè)柏葉總黃酮，通過單因素試驗，考察超聲波時間、超聲波溫度、超聲波頻率對黃酮得率的影響，并通過響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝。通過回歸模型預(yù)測得到超聲波法輔助提取側(cè)柏葉中黃酮的最佳工藝條件為：超聲波時間51 min、超聲波溫度60 ℃、超聲波頻率40 kHz，此時黃酮得率為（26.350±0.065）mg/g，優(yōu)化得到的工藝合理可行，為側(cè)柏葉黃酮的充分提取以及應(yīng)用提供了理論依據(jù)，同時也為超聲波法輔助提取其他中草藥活性物質(zhì)提供了新思路。