三斑海馬蛋白ACE抑制肽的制備及其二級結(jié)構(gòu)的研究

石杰，宿瑞奇，張文婷，陳健

（海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，海南海口570228）

近年來，高血壓日益成為影響世界上多數(shù)國家30%成年人的流行疾病。作為一種嚴(yán)重的慢性疾病，它能引起動脈硬化、中風(fēng)、心肌梗塞等高危疾病。同時，高血壓患者也呈現(xiàn)低齡化發(fā)展趨勢[1]。因此，尋求有效治療高血壓的方法迫在眉睫。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin I-converting enzyme，ACE）（EC 3.4.15.1） 是一種鋅金屬肽酶，通過腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）和激肽釋放酶激肽系統(tǒng)（kallikrein kinin system，KKS）對血壓起調(diào)節(jié)作用[2]。基于ACE作用原理，現(xiàn)已研發(fā)了一些合成的ACE 抑制劑，包括卡托普利（captopril），賴諾普利（lisinopril），依那普利（enalapril）和阿拉普利（alacepril）。它們對治療高血壓具有顯著療效，但也伴隨著咳嗽、味覺紊亂、皮疹、血管神經(jīng)性水腫等明顯的副作用[3]。因此，開發(fā)無毒、經(jīng)濟(jì)、安全有效的ACE 抑制劑顯得尤為重要。

三斑海馬（Hippocampus trimaculatus Leach）是一種隸屬于海龍科的海洋硬骨魚，主要分布在亞熱帶、熱帶的淺海區(qū)域[4]。近年來的研究表明其體內(nèi)富含甾體類、蛋白質(zhì)、脂肪酸、磷脂類等活性成分，特別是蛋白質(zhì)含量高達(dá)67.90%～73.56%（干重）[5-6]。三斑海馬作為亞洲地區(qū)傳統(tǒng)的海洋中藥材，具有抗疲勞、抗腫瘤、抗炎、抗衰老等生理功效[5-6]，因而具有廣闊的開發(fā)和應(yīng)用前景。

眾所周知，海馬作為海洋藥源性和觀賞性動物，具有極高的中醫(yī)藥價值。現(xiàn)有研究主要是海馬種群分布[7]、水溶性[8]或脂溶性[9]成分分析、長鏈堿[4]、糖脂[10]等，關(guān)于海馬蛋白提取的研究比較少。目前，人們已從多種海洋生物蛋白中分離得到ACE 抑制肽，如鮭魚[3]、蜥蜴魚[11]、太平洋鱈魚[12]等，這些研究表明海洋生物蛋白可作為提取ACE 抑制肽的重要來源。然而，關(guān)于海馬ACE 抑制肽的分離純化尚未見到報道。

本試驗(yàn)以三斑海馬為原料，以ACE 抑制活性為指標(biāo)。通過酶解，連續(xù)色譜分離，并對反相高效液相色譜分離得到的ACE 抑制活性最高組分進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，成功分離得到一種ACE 抑制肽，并分析其二級結(jié)構(gòu)。本研究為三斑海馬蛋白的提取，開發(fā)治療高血壓的功能性食品提供了一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三斑海馬干品：海南龍盛生物科技發(fā)展有限公司；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）（來源于兔肺，2.0 U/mg）、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（HHL）：美國 Sigma 公司；堿性蛋白酶（2×106U/g）、葡聚糖凝膠 G-25：北京索萊寶科技有限公司；乙腈（色譜純）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）（色譜純）：上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

真空干燥箱（AY-DZF-6210）：上海尚群電子科技有限公司；恒流泵（HL-2）：蘇州江東精密儀器有限公司；電子天平（AUW220）：廈門群隆儀器有限公司；電腦自動部分收集器（DBS-160F）：上海精科實(shí)業(yè)有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-4）：江蘇盛藍(lán)儀器制造有限公司；冷凍干燥機(jī)（ALPHA 1-2）：北京五洲東方科技發(fā)展有限公司；紫外可見分光光度計（UV757CTR）：上海儀電分析儀器有限公司；反相高效液相色譜儀（Agilent 1260）：美國安捷倫科技有限公司；圓二色光譜儀（Chirascan）：英國應(yīng)用光物理公司。

1.3 方法

1.3.1 脫脂三斑海馬粉末的制備

將三斑海馬干品用蒸餾水洗凈，并去除內(nèi)臟等，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中60 ℃烘干至恒重，粉碎，過60 目篩。稱取一定質(zhì)量的三斑海馬粉末置于燒杯中，按料液比1 ∶6（g/mL）加入乙酸乙酯，恒溫磁力攪拌器上脫脂30 min，抽濾，收集濾液，重復(fù)脫脂過程3 次，將脫脂處理的三斑海馬粉末于烘箱中40 ℃蒸干乙酸乙酯。

1.3.2 三斑海馬酶解產(chǎn)物的制備

參照徐克寒等[13]的方法，使用堿性蛋白酶，在其最適溫度和pH 值條件下，制備三斑海馬酶解產(chǎn)物。稱取適量脫脂三斑海馬粉末，按料液比1 ∶15（g/mL）加入去離子水，混勻，調(diào)節(jié)pH 值至9.5，按1.0%加酶量，60 ℃酶解6 h，沸水浴10 min 滅酶，終止反應(yīng)。酶解液冷卻至 25 ℃，抽濾收集濾液，離心（5 000 r/min，20 min），取上清液，冷凍干燥成粉末，-20 ℃隔光隔氧保存。

1.3.3 分離和純化ACE 抑制肽

1.3.3.1 透析

對三斑海馬酶解液進(jìn)行透析處理。4 ℃條件下，將酶解液于置于磁力攪拌器上透析72 h，每隔6 h～8 h 換一次超純水，透析完后冷凍干燥得到透析產(chǎn)物，-20 ℃隔光隔氧保存。

1.3.3.2 Sephadex G-25 凝膠柱分離純化

選用Sephadex G-25 凝膠對透析產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，將預(yù)處理好的葡聚糖凝膠采用自然沉降法裝填至1.6 cm×90 cm 的玻璃層析柱中，平衡4 h～5 h，調(diào)節(jié)流速至0.3 mL/min，透析產(chǎn)物溶于超純水配成50 mg/mL溶液，過0.45 μm 針孔式濾膜，上樣體積2 mL，用超純水洗脫，自動部分收集器每10 min 收集一管，檢測波長280 nm，按峰分別多次收集洗脫液，冷凍干燥，-20 ℃隔光隔氧保存。

1.3.3.3 反相高效液相色譜分離純化

將Sephadex G-25 凝膠層析分離得到的ACE 抑制活性最強(qiáng)組分以超純水（含0.1%TFA）溶解，配成30 mg/mL 溶液，過 0.22 μm 針孔式濾膜，以反相高效液相色譜儀分離純化，按峰分別多次收集洗脫液，冷凍干燥，測定各組分峰ACE 抑制活性。

色譜條件：ODS HYPERSIL C18（10 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；上樣量：100 μL；洗脫流速：3 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測波長：215 nm；流動相 A：超純水（含0.1%TFA）；流動相 B：乙腈（含 0.1 % TFA）；洗脫條件：0～10 min，10%B，10 min～50 min，10%～42%B。

1.3.4 測定ACE 抑制活性

參照Ko 等[14]的方法測定ACE 抑制活性，稍做修改后使用。取50 μL 待測樣品溶液和150 μL 8.3 mmol/L HHL 溶液（含 0.3 mol/L NaCl，pH 8.3）于 2 mL 離心管中，混勻，37 ℃水浴預(yù)熱 5 min 后，向離心管中加入 50 μL 0.025 U/mL ACE 溶液（ACE 溶于含 0.3 mol/L NaCI 硼酸緩沖液，pH 8.3），混勻，于 37 ℃水浴 1 h 后，加入 250 μL 1 mol/L HCl 溶液終止反應(yīng)，混勻。再加入1.5 mL 乙酸乙酯萃取反應(yīng)生成的馬尿酸，混勻，離心（3 000 r/min，10 min），移取 1 mL 上清液于 5 mL 離心管中，真空濃縮3 h 蒸干乙酸乙酯，再加3 mL 去離子水復(fù)溶，混勻，于228 nm 波長處測定吸光度值。按下式計算ACE 抑制率。

式中：AS為樣品組的吸光度值；AB為空白組的吸光度值；AC為對照組的吸光度值。

1.3.5 鑒定ACE 抑制肽的氨基酸序列和分子量

委托生工生物工程（上海）股份有限公司鑒定反相高效液相色譜純化得到的ACE 活性最高組分的氨基酸序列和分子量。樣品溶于0.1%甲酸水溶液，自動進(jìn)樣器上樣于LTQ Orbitrap Velos Pro 質(zhì)譜儀。儀器使用前經(jīng)丁螺環(huán)酮標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)液校正。正離子檢測，離子源為ESI，噴霧電壓：1.8 kV，離子傳輸毛細(xì)管溫度：250 ℃，掃描范圍：50 m/z ～750 m/z，質(zhì)譜掃描方式為信息依耐采集工作模式，碎裂方式為碰撞誘導(dǎo)解離。使用Mascot 2.3 軟件從海馬數(shù)據(jù)庫中自動匹配得到多肽序列。

1.3.6 圓二色光譜分析

委托生工生物工程（上海）股份有限公司使用圓二色光譜法分析純肽的二級結(jié)構(gòu)。取適量樣品溶于20 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 7.2），使其濃度為0.2 mg/mL，取200 μL 溶液上樣于圓二色光譜儀，使用石英比色皿，在 25 ℃、190 nm～260 nm 條件下掃描，帶寬1.0 nm，掃描速率120 nm/min，磷酸鹽緩沖液作為空白，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。采用CDNN 軟件計算α 螺旋，β 折疊，β 轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲的含量。

1.3.7 傅里葉變換紅外光譜

在紅外燈照射下，取適量ACE 抑制活性最強(qiáng)的層析分離組分，與KBr 粉末混勻，充分研磨后壓成透明薄片，通過傅里葉變換紅外光譜儀，在4 000 cm-1～400 cm-1內(nèi)測定ACE 抑制活性最強(qiáng)的層析分離組分紅外吸收光譜。

1.3.8 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 21.0 分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，Origin Pro 9.1 軟件作圖，采用ANOVA 分析數(shù)據(jù)間差異，P＜0.05，表示差異有顯著意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 三斑海馬酶解產(chǎn)物的制備

多項(xiàng)研究表明，堿性蛋白酶酶解食源性蛋白質(zhì)得到的產(chǎn)物具有潛在的生物活性，如抗氧化活性[15-16]和ACE 抑制活性[17-18]。這些多肽的生物活性歸因于堿性蛋白酶具有內(nèi)切肽酶的性質(zhì)。此外，堿性蛋白酶酶解蛋白質(zhì)產(chǎn)生的短肽序列，可解釋這些生物活性，包括ACE 抑制活性[19-20]。試驗(yàn)中選用堿性蛋白酶酶解三斑海馬制備富含ACE 抑制肽的酶解產(chǎn)物，其IC50值為（0.81±0.12）mg/mL。因?yàn)槊附猱a(chǎn)物具有ACE 抑制活性，證明了堿性蛋白酶酶解蛋白質(zhì)所得產(chǎn)物的ACE 抑制活性。

2.2 三斑海馬蛋白ACE抑制肽的分離和純化

2.2.1 透析

酶解物和透析產(chǎn)物的IC50值見表1。

表1 酶解物和透析產(chǎn)物的IC50 值Table 1 The IC50 values of hydrolysate and dialysis product

試驗(yàn)中對酶解液進(jìn)行透析處理，透析完成后冷凍干燥，并測定透析產(chǎn)物的ACE 抑制活性，相比酶解產(chǎn)物而言，透析產(chǎn)物具有更強(qiáng)的ACE 抑制活性，其IC50值為（0.44±0.26）mg/mL。以上結(jié)果表明，從三斑海馬蛋白中分離純化ACE 抑制肽是可行的。

2.2.2 Sephadex G-25 凝膠柱分離純化

葡聚糖凝膠層析，又稱分子排阻層析，是一種依據(jù)待分離物質(zhì)的分子量大小進(jìn)行分離的技術(shù)[21]。葡聚糖凝膠層析譜圖見圖1。

圖1 葡聚糖凝膠層析譜圖Fig.1 Elution profile of sephadex G-25 gel filtration chromatography

如圖1 所示，透析產(chǎn)物經(jīng)葡聚糖凝膠G-25 進(jìn)一步分離純化，得到3 個吸附峰，分別標(biāo)記為F1，F(xiàn)2 和F3。將各組分配成1 mg/mL 溶液，并測定其ACE 抑制活性，如圖2 所示。

圖2 Sephadex G-25 分離各組分 ACE 抑制率（，n=3）Fig.2 The ACE-inhibiting activity of each fraction separated by sephadex G-25 gel filtration chromatography（，n=3）

組分F2 的ACE 抑制率最高，為（92.51± 0.49）%，IC50值為（0.11± 0.08）mg/mL。相比透析產(chǎn)物，其 ACE抑制活性明顯增強(qiáng)，因此F2 用于進(jìn)一步分離純化。

2.2.3 反相高效液相色譜分離純化

反相高效液相色譜是一種依據(jù)物質(zhì)在固定相和流動相中分配系數(shù)、吸附能力等親和能力的不同而將物質(zhì)分離的色譜方法，具有分析速度快，分離效果好和靈敏度高等特點(diǎn)[21]。

試驗(yàn)中采用RP-HPLC 對葡聚糖G-25 凝膠分離得到的ACE 抑制活性最高組分F2 進(jìn)一步分離純化，如圖3 所示。

F2 經(jīng)反相高效液相色譜分離后，得到6 個具有ACE 抑制活性的峰，分別標(biāo)記為 F2-1，F(xiàn)2-2，F(xiàn)2-3，F(xiàn)2-4，F(xiàn)2-5 和F2-6。由圖3 可知，洗脫過程中產(chǎn)生了大量多肽，樣品中存在的親水性鹽氯化鈉可能影響了分離效果。分別測定各峰ACE 抑制活性，結(jié)果如圖4所示。

圖3 F2 經(jīng)反相高效液相色譜純化色譜圖Fig.3 Purification of F2 by reversed-phase high performance liquid chromatography

圖4 F2 經(jīng) RP-HPLC 分離各組分 ACE 抑制率（，n=3）Fig.4 The ACE-inhibiting activity of each fraction separated by RP-HPLC（，n=3）

組分 F2-4 的 ACE 抑制活性最強(qiáng)，0.5 mg/mL 的F2-4 的 ACE 抑制率為 （93.91 ± 2.18）%，IC50值為（0.005 7± 0.000 9）mg/mL。因此，F(xiàn)2-4 用于鑒定 ACE抑制肽分子量和氨基酸序列。

2.4 ACE抑制肽分子量和氨基酸序列的鑒定

試驗(yàn)通過電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（electrospray ionizationtandem mass spectrometry，ESI-MS/MS）鑒定反相高效液相色譜（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）分離得到的ACE 抑制活性最強(qiáng)組分F2-4 的氨基酸序列和分子量，如圖5 所示，多肽序列為 Pro-Ala-Gly-Pro-Arg-Gly-Pro-Ala（PAGPRGPA），分子量為 721.39 Da。

圖5 F2-4 二級質(zhì)譜圖Fig.5 The secondary mass spectrum of F2-4

不同來源的海洋魚類蛋白ACE 抑制肽見表2。

表2 不同來源的海洋魚類蛋白ACE 抑制肽Table 2 Marine fish protein ACE inhibitory peptide from different resources

如表2 所示，近年來，人們從各種來源的海洋魚類蛋白中分離出多種ACE 抑制肽。相比較而言，從三斑海馬蛋白中分離得到的ACE 抑制肽具有相近或更強(qiáng)的ACE 抑制活性。

生物活性肽通常含有3～20 個氨基酸，低分子量的多肽比高分子量的多肽更有可能成為生物活性肽[22]。ACE 抑制劑通常含有1 或2 個分子功能受體，如鋅結(jié)合配體，1 個氫鏈供體和羧基端基基團(tuán)[24]。考慮到多肽結(jié)構(gòu)和ACE 抑制活性的關(guān)系，通常，多肽C 末端有芳香族氨基酸，如脯氨酸（Pro）、苯丙氨酸（Phe）或酪氨酸（Tyr），N 末端有脂肪族氨基酸，如纈氨酸（Val）或異亮氨酸（Ile），具有較強(qiáng)抑制活性[25]。Wu[26]等人通過計算分析提出ACE 抑制肽模型。他們認(rèn)為，N 末端含有疏水性氨基酸殘基，中間帶有正電荷氨基酸，C 末端帶有芳香族氨基酸殘基的多肽顯示更強(qiáng)的ACE 抑制活性。盡管ACE 抑制肽的結(jié)構(gòu)活性關(guān)系還沒完全建立，這些多肽具有一些共同的結(jié)構(gòu)特征。實(shí)驗(yàn)成功從三斑海馬蛋白中分離得到一種ACE 抑制肽，其多肽序列中含有三個脯氨酸（Pro）和兩個丙氨酸（Ala），均為疏水性氨基酸，可能對ACE 抑制活性具有促進(jìn)作用。

2.5 圓二色光譜分析

圓二色譜已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于研究蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)、動力學(xué)和折疊。二級結(jié)構(gòu)，如α 螺旋，β 折疊和β轉(zhuǎn)角在波長190 nm～260 nm 范圍內(nèi)有圓二色性[27]。α螺旋占優(yōu)勢的蛋白質(zhì)在193 nm 附近有正橢圓率，222 nm和208 nm 處有負(fù)橢圓率。β 折疊占優(yōu)勢的蛋白質(zhì)在218 nm 有負(fù)橢圓率，195 nm 有正橢圓率。無序蛋白質(zhì)在高于210 nm 時有很低的橢圓率，195 nm 附近有負(fù)橢圓率[28]。多肽遠(yuǎn)紫外圓二色譜圖如圖6 所示。

圖6 多肽遠(yuǎn)紫外圓二色譜圖Fig.6 The far-UV circular dichroism spectrum of the purified peptide

圓二色譜圖顯示其在198 nm 附近有一個負(fù)峰，217 nm～225 nm 波長范圍內(nèi)有一個肩峰，無典型的α螺旋和β 折疊的結(jié)構(gòu)特征。多肽二級結(jié)構(gòu)預(yù)測見表3。

表3 多肽二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Table 3 The prediction of the purified peptide secondary structure

試驗(yàn)中測定了4 種不同的二級結(jié)構(gòu)，分別為α 螺旋，β 折疊，β 轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲。如表3 所示，多肽由6.0% α 螺旋，31.5% β 折疊，31.4% β 轉(zhuǎn)角和 35.6%無規(guī)則卷曲組成。試驗(yàn)結(jié)果與Rhiannon[29]等的結(jié)果類似。

2.6 紅外光譜分析

層析分離組分F2 的紅外光譜圖如圖7 所示。

圖7 層析分離組分F2 紅外光譜圖Fig.7 The FT-IR spectrum of F2

3 402.15 cm-1附近，強(qiáng)且寬的特征吸收峰是由OH 伸縮振動引起的，而2 963.48 cm-1處的吸收峰是由C-H 伸縮振動引起的。1 650.98 cm-1處最強(qiáng)的吸收峰是由酰胺基團(tuán)中C=O 不對稱伸縮振動引起的。1 544.17 cm-1處較強(qiáng)的吸收峰與酰胺基團(tuán)中NH 伸縮振動有關(guān)。在1 401.98 cm-1處的吸收峰是由胺基基團(tuán)中CN 伸縮振動引起的。上述結(jié)果表明F2 中存在肽鍵。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過堿性蛋白酶酶解三斑海馬蛋白制備含有ACE 抑制肽的酶解物，研究了酶解物、透析產(chǎn)物、葡聚糖凝膠分離各組分及反相高效液相色譜純化各組分的ACE 抑制活性，并對反相液相色譜分離得到的ACE 抑制活性最強(qiáng)最分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，成功從三斑海馬蛋白中分離得到一種ACE 抑制肽：Pro-Ala-Gly-Pro-Arg-Gly-Pro-Ala（分子量：721.39 Da），其 IC50值為（0.005 7±0.000 9）mg/mL，具有較強(qiáng)的ACE 抑制活性。圓二色譜分析顯示其無規(guī)則卷曲含量較高。本試驗(yàn)為三斑海馬蛋白多肽的開發(fā)利用提供了一定的理論基礎(chǔ)。