抗抑郁樣及焦慮樣行為乳酸菌的篩選

孫也，潘婭婧，楊菁楠，侯旭彤，王金菊，王艷萍

（天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津300457）

據世界衛生組織統計，目前全球抑郁癥患者已達3.22 億，占全球范圍內總人口數的4.3 %[1]。我國從2005 年到2015 年，抑郁患者數量增加了18.4%。據不完全統計，目前我國抑郁癥發病率高達5%～6%，而且發病率近年來呈逐年上升的趨勢。抑郁癥患病人群主要集中在孕婦、產后婦女及老年人，年齡小于15 歲的兒童和青少年也有發生。不同文化程度、國籍、地域、工作崗位、年齡的人群患病率各不相同[2]。抑郁癥嚴重影響我們的生活、學習和健康。抑郁癥已成為科研工作者攻克的難題和研究的熱點。

目前抑郁癥主要的治療措施是藥物治療，然而藥物具有很大的副作用。所以開發一款天然、無副作用的抗抑郁制劑來替代抗抑郁藥物成為研究熱點。目前國內外研究人員已經證實多種益生菌菌株可顯著緩解抑郁或焦慮，并有望成為抗抑郁藥的替代品[3-15]。

然而在進行抗抑郁乳酸菌的篩選時，模型的選擇十分重要。本試驗選用明暗箱和高架十字迷宮來評估小鼠的焦慮樣行為。明暗箱實驗是基于嚙齒動物對明亮光照區域的天生厭惡，以及嚙齒動物對溫和應激源（即新的環境和光線）的自發探索行為[16]；高架十字迷宮測試可以評估小動物的焦慮樣行為。正常健康的小動物會出于好奇對新環境進行探索，表現為在開臂的逗留時間增加；選用懸尾試驗實驗來評估小鼠的抑郁樣行為。懸尾實驗已經成為評估小鼠抗抑郁類藥物活性最廣泛使用的模型之一，這項測試是基于這樣一個事實：動物在短期內，不可避免地承受著被尾巴懸掛的壓力，它們會形成一種不動的姿勢。各種抗抑郁藥物逆轉了這種靜止狀態，促進了逃避行為的發生[17-18]。

本試驗采用行為學模型來評估7 株乳酸菌的抗抑郁樣行為和抗焦慮樣行為，為以后的研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

JA2003 電子分析天平：上海精科天平廠；DWYL270 冰箱：中科美菱公司；YQX-2 厭氧培養箱：上海躍進醫療公司；LGR20 高速冷凍離心機：北京京立離心機。

氯化鈉（分析純）：北京奧博星生物技術有限公司；5-羥色胺測定試劑盒、皮質酮測定試劑盒：天津萊博科技有限公司。

1.2 試驗菌種與動物

主要采用以下菌株用于本研究，試驗菌株信息表見表1。菌種保藏在中國科學院微生物研究所菌種保藏中心。7 株乳酸菌在MRS 肉湯培養基（葡萄糖20.0 g/L；蛋白胨10.0 g/L；牛肉膏10.0 g/L；酵母膏5.0 g/L；磷酸二氫鉀2.0 g/L；檸檬酸銨2.0 g/L；醋酸鈉5.0 g/L；吐溫80 1.0 g/L；硫酸錳 0.05 g/L；硫酸鎂 0.2 g/L）中 30 ℃培養48 h。昆明雄性小鼠（SPF 級，北京斯貝福），飼養于天津科技大學屏障系統動物房中。所有試驗均依照《天津科技大學動物管理與使用指南》進行。

1.3 試驗方法

1.3.1 動物實驗設計

試驗小鼠在適應環境一周之后被隨機分成8 組，每組8 只，分別為空白對照組、ZW3 組、WHC1 組、MA2 組、299 組、563 組、XL10 組、W120 組?？瞻讓φ战M每天灌胃無菌生理鹽水（0.85 %）0.4 mL；乳酸菌組每天灌胃 0.4 mL 菌液（108CFU/mL）灌胃 4 周。

四是“訂單式”培訓模式。“訂單式”培訓可以根據地區特有的產業特色，將農民生產中的需求與就業、培訓建立了對應關系，進而生成高效的銜接機制。該模式可以重點用于對農民實用技術和增收致富技能等的培育，例如教會農民養殖技術、種植實用技術等。

1.3.2 明暗箱實驗

明暗箱實驗方法參考Premysl bercik[19]。實驗需要在安靜環境下進行，將動物放入長寬高分別為80、80、40 cm 的箱內（一半有遮擋為暗箱，一半敞箱為明箱），將動物放入敞箱后開始測定，每次計時10 min，記錄單位時間內動物在亮箱中停留的總時間。小鼠在亮處停留時間越長說明小鼠越不焦慮。

1.3.3 高架十字迷宮實驗

高架十字迷宮實驗方法參考Bravoa 中的描述[20]。實驗裝置包括兩個開臂和兩個閉臂，開臂由兩個兩邊長為100 cm 平臺構成無護欄；閉臂由兩個兩邊長為100 cm 平臺構成，合臂邊緣有20 cm 護欄。測試中，將測試小鼠放置在十字中央區域，隨即開始記錄與觀察小鼠在開臂中停留的時間，測試進行5 min。與對照相比，在開臂停留時間越短表明小鼠對新環境的探究能力差，從而體現出焦慮抑郁樣行為。

1.3.4 懸尾實驗

懸尾實驗實驗方法參考徐立[21]，當被懸掛的小鼠靜止不動則視為抑郁。將小鼠尾端1 cm 的部位貼在一鐵架夾上，頭朝下，使小鼠前后左右均無攀抓的地方，一段時間后小鼠因絕望而活動減少，記錄小鼠6 min內后4 min 的不動時間。

1.3.5 強迫游泳實驗

強迫游泳實驗方法參考Cryan 中的描述[21]。強迫游泳實驗是經典的抑郁模型，通過小鼠在水面漂浮的不動時間可以檢測小鼠抑郁行為。強迫游泳實驗前，分別將小鼠置于強迫游泳缸（水深10 cm、直徑16 cm、水溫保持在25 ℃）內進行預適應游泳15 min，然后用毛巾擦干，24 h 后進行強迫游泳6 min，計算小鼠后4 min 在水面漂浮的累計不動時間。不動時間判斷標準：小鼠停止掙扎或呈漂浮狀態，四肢有輕微動作以保持在水面漂浮即為不動。

1.3.6 生物標記物的測定

1）小鼠于最后一次行為學測試后禁食24 h 處死，各組小鼠摘眼球取血，取得的血液收集在無菌的1.5 mL EP 管中，迅速在4℃，6 000 r/min 的條件下離心10 min后取上清，將收集的血清用液氮冷凍之后存儲在-80 ℃直至使用[21]。

2）斷頭取腦，隨即迅速于冰面上分離出下丘腦，并根據實驗要求分裝于1.5 mL EP 管中，置于液氮冷凍之后存儲在-80 ℃直至分析。

3）使用酶聯免疫分析ELISA 試劑盒檢測各指標，按試劑盒說明書進行操作

1.4 數據分析

所有數據均以均值±標準差表示，采用One-way ANOVA 比較差異。p＜0.05 有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌對健康小鼠在明暗箱實驗中的影響

為評估乳酸菌對健康小鼠焦慮樣行為的作用，分別觀察灌胃乳酸菌2 周和4 周時，小鼠在明暗箱實驗的情況。將動物放入敞箱后開始測定，每次計時10 min，記錄單位時間內動物在亮箱中停留的總時間。結果如圖1 所示。

由圖1 可知，與空白小鼠相比，灌胃了益生菌的實驗組小鼠在亮箱中停留時間更長一些；灌胃2 周時，除了XL10，益生菌組在亮箱中停留時間都顯著的高于空白組（p＜0.05）；灌胃4 周時，益生菌組與空白組相比在亮箱里的停留時間顯著增加（p＜0.05）。表明灌胃益生菌 2 周時 ZW3、MA2、299、W120、563、WHC-1 菌株可顯著改善小鼠的焦慮樣行為，并且繼續灌胃至第四周時，也表現出了相同的效果。之前的一份報告指出，A-gusti 給感染了T.muris 的小鼠服用B.longum 后，與未感染的正常小鼠相比，小鼠在亮箱中停留的總時間正?；痆22]。結果表明Lb.kefiranofaciens ZW3 可改善小鼠在新環境中的焦慮樣行為。

圖1 各組小鼠在明暗箱中亮箱停留時間Fig.1 Time in light box

2.2 乳酸菌對健康小鼠在高架十字迷宮實驗中的影響

采用高架十字迷宮實驗，進一步評估益生菌對健康小鼠焦慮樣行為的作用，我們觀察了灌胃乳酸菌四周時，小鼠在高架十字迷宮實驗的情況。將測試小鼠放置在十字中央區域，隨即開始記錄與觀察小鼠在開臂中停留的時間，測試持續5 min。結果如圖2 所示。

圖2 灌胃益生菌四周時各組小鼠在開臂中停留時間Fig.2 Stay time of open arm of mice were administered for four weeks

由圖2 可知，灌胃益生菌四周時，與空白對照組相比ZW3、MA2、299 可顯著增加小鼠在開臂中的停留時間（p＜0.05）。Bravo 研究發現長期服用鼠李糖乳桿菌（JB-1）可以延長小鼠在高架十字迷宮中開臂的停留時間[20]。另一份報告顯示，服用Lactobacillus helveticus NS8 的限制性應激大鼠，在高架十字中開臂的探索時間增加[23]。表明益生菌可改善小鼠在新環境中的焦慮樣情緒。

2.3 乳酸菌對健康小鼠在懸尾實驗中的影響

采用經典的行為絕望模型懸尾實驗，來評估乳酸菌對實驗小鼠的作用效果。將小鼠尾端1 cm 的部位貼在一鐵架夾上，頭朝下，使小鼠前后左右均無攀抓的地方，一段時間后小鼠因絕望而活動減少，記錄小鼠6 min 內后4 min 的不動時間。結果如圖3 所示。

圖3 各組小鼠在懸尾中不動時間Fig.3 Immobility time of tail suspension test administered for four weeks

由圖3 可知，灌胃益生菌2 周時，與空白組小鼠相比，ZW3、299、MA2、W120 組小鼠的不動時間明顯降低；繼續灌胃益生菌到第四周時，ZW3、299、MA2、563、XL10 組小鼠不動時間與對照組相比明顯下降（p＜0.05），但是不動時間較2 周有所延長。結果說明ZW3，299，MA2 在灌胃 2 周時就具有減輕小鼠抑郁樣行為的潛能，而563，XL10 在灌胃4 周時才表現出減輕小鼠抑郁樣行為的潛能。

通過明暗箱和高架十字迷宮實驗評價7 株益生菌對健康小鼠在新環境中抗焦慮樣行為的作用效果：綜合結果顯示ZW3、MA2、299 在兩個行為學實驗中均可改善小鼠在新環境中的焦慮樣行為；通過懸尾實驗評價7 株益生菌對健康小鼠在行為絕望模型中的作用效果：綜合結果顯示 563、ZW3、MA2、299、XL10 在兩個行為學實驗中均可改善小鼠的抑郁樣行為。

本文通過行為學篩選到3 株抗抑郁/抗焦慮樣行為的乳酸ZW3、MA2、299 作為后續研究的菌株。

2.4 抗抑郁/抗焦慮乳酸菌對小鼠臟器指數的影響

行為學測試結束后，對小鼠進行解剖，用電子天平測量各臟器的質量，結果如表2 所示。

表2 益生菌對小鼠臟器指數的影響Table 2 Effect of probiotics on the organ index in SPF mice

在試驗期間，各組小鼠均健康良好，皮毛光澤干凈，飲食正常，沒有死亡現象，表明這3 株乳酸菌對小鼠沒有副作用。

2.5 抗抑郁/抗焦慮乳酸菌對小鼠體內生物標記物的影響

采用ELISA 方法測定抑郁相關生物標記物血清素和皮質酮的含量，結果如圖4 所示。

圖4 Lb.kefiranofaciens ZW3 對小鼠體內生物標記物的作用Fig.4 Lactobacillus kefiranofaciens ZW3 administration influenced biomarkers levels in mice

腦區內5-羥色胺（serotonin，5-HT）水平低或者抑制血清素分泌的功能被認為是抑郁癥發病的機制[24]。由圖4（a）可知，與空白組相比，補充益生菌ZW3、MA2、299 可以增加下丘腦中5-HT 的含量；當宿主受到壓力時，下丘腦釋放促腎上腺皮質激素釋放激素，誘導垂體釋放促腎上腺皮質激素，從而導致腎上腺皮質釋放皮質酮，皮質酮等物質調控腸道免疫細胞的活動，影響腸道的滲透性和屏障功能并改變腸道菌群的結構[25]。由圖4（b）可知，與空白組相比，補充益生菌ZW3、MA2、299 可以降低血清中皮質酮的水平。結果表明ZW3、MA2、299 可以調節抑郁相關的生物標記物。

3 結論

通過明暗箱和高架十字迷宮來評估飲食中補充乳酸菌對健康小鼠焦慮樣行為的作用效果，結果表明，ZW3、MA2、299 可以增加小鼠在明暗箱中亮箱的停留時間，以及小鼠在高架十字迷宮中開臂的探索時間，從而改善了健康小鼠在面對新異環境的焦慮樣情緒；通過懸尾實驗來評估飲食中補充乳酸菌對健康小鼠抑郁樣行為的作用效果，結果表明，563、ZW3、MA2、299、XL10 可以降低小鼠在懸尾實驗中的不動時間，從而改善了健康小鼠在面對應激的抑郁樣情緒。本文通過行為學篩選到3 株抗抑郁/抗焦慮樣行為的乳酸ZW3、MA2、299 作為后續研究的菌株。同時 ZW3、MA2、299 還可以增加小鼠下丘腦中5-HT 含量，降低小鼠血清中皮質酮含量。綜上所述，ZW3、MA2、299 可以改善小鼠的焦慮樣行為和抑郁樣行為，并且初步探討了這些行為的改變可能和體內生物標記的水平相關。為今后的研究提供了基礎。