一株海洋蛭弧菌的裂解譜和鹽度耐受性分析

近年來，由弧菌導致的水產動物病害頻繁發生，弧菌病害已成為海水養殖病害最重要的防治對象之一。蛭弧菌(Bdellovibrio bacteriovorus)是一類專門以捕食細菌為生的寄生性細菌，由于它具有寄生和裂解許多魚類和水體致病性細菌的作用，在生物預防弧菌方面日益顯出其優越性。水產用噬菌蛭弧菌優良菌種的篩選獲得是其后續研究開發與應用的重要保障，基于此，本實驗對本實驗室保存的一株海洋蛭弧菌BD-zr-11(分離自海水養殖池)進行了裂解譜分析和鹽度耐受性分析，旨在為該菌株在海水養殖中的潛在應用提供一定科學依據和數據支撐。

一、材料與方法

1.實驗材料

(1)海洋蛭弧菌BD-zr-11為本實驗室保存，分離自海水養殖池。

(2)宿主菌株共7株，分別為嗜水氣單胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、哈維氏弧菌、大腸桿菌、鰻弧菌以及金黃色葡萄球菌，均為實驗室保存，分離自南美白對蝦肝胰腺、腸道或不同養殖環境水樣。

(3)營養肉湯、瓊脂購自國藥集團化學試劑有限公司。

(4)儀器設備：震蕩培養箱(HZQ-F160)、高速冷凍離心機(TGL-20bR)和細菌濁度儀(WGZ-XT)。

2.實驗方法

(1)裂解譜測定。將上述7種宿主菌分別接種于50毫升滅菌營養肉湯液體培養基中，置于37℃震蕩培養箱中培養18小時，轉速為120轉/分；4℃、5000轉/分條件下離心30分鐘，收集菌體；用無菌生理鹽水洗滌兩次，離心收集菌體后用生理鹽水重新懸浮，細菌濁度儀測定比濁度，調整終濃度為1×1012CFU/毫升。將制備好的宿主菌菌懸液置于4℃冰箱中保存備用。采用雙層瓊脂平板法對公司蛭弧菌產品進行裂解譜分析，雙層瓊脂平板培養基下層為1.2%瓊脂、上層為0.8%瓊脂，每個細菌做3個平板，記錄噬菌斑出斑時間及噬菌斑數量。根據形成的噬菌斑數量判斷蛭弧菌對宿主菌侵染裂解作用。噬菌斑形成數量越多，表明蛭弧菌對某一宿主的侵染裂解效率越強。

(2)鹽度耐受性分析。參照程俊茗等人的方法，我們選擇0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%和3.5%共7個鹽度梯度進行試驗，采用雙層瓊脂平板培養法，根據形成噬菌斑數量判斷蛭弧菌對鹽度的耐受性，并測定其最佳生長鹽度。

二、結果

1.裂解譜分析

由圖1可知，7種宿主菌中，蛭弧菌BD-zr-11對鰻弧菌、金黃色葡萄球菌雖然沒有表現出噬菌能力，但是對嗜水氣單胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、哈維氏弧菌以及大腸桿菌這5種致病菌均具有良好的裂解能力，且表現為對嗜水氣單胞菌和副溶血弧菌的裂解能力較對其他3株弧菌強。這與WILLIAMS HN、PINEIRO SA、RICE TD等人的研究報道一致。5株敏感菌均從48小時后開始出現噬菌斑，首先表現為點狀，隨著時間延長，噬菌斑逐漸擴大。

圖1 蛭弧菌BD-zr-11形成的噬菌斑

2.鹽度耐受性分析結果

由圖2結果可知，鹽度對蛭弧菌的生長有明顯的影響。蛭弧菌菌株對鹽度的耐受范圍是5～35，鹽度較低時，蛭弧菌的生長不良，蛭弧菌在鹽度15～35的范圍內生長狀況良好，最適生長鹽度為25，數量級為104，是一株廣鹽性菌株。

圖2 不同鹽度對蛭弧菌BD-zr-11生長的影響

三、討論

由于滲透壓的關系，根據不同的養殖環境投放不同來源(海水或淡水)的蛭弧菌，才能保證最大限度地發揮蛭弧菌的效價。本實驗所用蛭弧菌BD-zr-11不僅對海洋致病菌副溶血弧菌、溶藻弧菌、哈維氏弧菌有裂解能力，對淡水致病菌嗜水氣單胞菌和大腸桿菌也有較好的裂解能力，具有一定的潛在開發利用前景，但在實際應用中，其裂解能力可能會受到溫度、鹽度、環境污染物等多方面的影響。雖然該株蛭弧菌對鹽度耐受性較廣，但在鹽度為5及更低鹽度下，蛭弧菌的生長、繁殖受到抑制，導致其在淡水養殖上應用受限。

另外，本文所選水產養殖常見致病菌種類有限，其噬菌范圍有待進一步的擴展驗證。該株蛭弧菌的實驗室應用效果、對有益菌有無殺滅效果，在不同養殖品種、不同水質條件、不同使用濃度下的臨床應用研究有待進一步驗證。